歯周病予防に向けた病原菌の生育阻害剤の開発：その基礎的研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26560405
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 平岡 行博 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 教授 (20097512)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (20350829) ; 山下 照仁 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (90302893)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: SOD / 酵素 / 歯周病原菌 / 金属選択性

Outline of Annual Research Achievements

研究の目的：　歯周病は生活習慣病を惹起し、また悪化させる原因と認識されてきた。そこで、歯周病原菌の一種、Porphyromonas gingivalis のサバイバルに必須の酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ ( SOD )の阻害剤の開発を目指して特徴的な構造を明らかにすることを目的とした。本酵素は、嫌気下ではFeを配位し、好気下ではMnを配位して活性を発現する。この原因を活性中心近傍に配置するアミノ酸残基の機能として捉え、アミノ酸の変異体を作製して、個々の残基の機能を明らかにしようとしている。今までの成果として、N末端から155番目にあるGly（Gly-155）は、活性中心から11Å離れていながら、活性発現の金属依存性に関わっていた事を明らかにできた。今回、この残基と近距離にあってP.g. SODの特徴的な残基と推測されるLeu -72とLeu-76に対し、変異を作製して協奏的挙動関係の有無を明らかに出来れば、金属特異性を支える構造を限定化することが可能になると考えた。
平成26年度の研究実績：　P.g. SODのLeu -72をTrpに単独変異させた（Leu 72Trp）変異体、および、これにLeu 76Phe変異を加えた二残基変異体を作製した。Leu 72Trp変異酵素は電気泳動的に野生型酵素と同一の挙動を示し、総体の構造が野生型酵素と同等であると考えられた。また、Leu 72TrpおよびLeu 76Pheの二残基変異体も、電気泳動的に分子の構造が野生型酵素と同等であると考えられた。酵素活性値を比較した結果から、Leu72とLeu 76は、Pg SODの金属寛容性を支持する役割を持つアミノ酸残基の候補になり得ると結論付けた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

P.g. SODのLeu -72をTrpに単独変異させた（Leu 72Trp）変異体、および、これにLeu 76Phe変異を加えた二残基変異体の作製は、前年度からの課題として実施中であった。部位特異的変異に用いたKunkel の方法は、煩雑さがあるものの効率がよく、また同時に複数箇所に変異を導入できるというメリットがあるため、これを採用した。標的塩基以外に変異の無い事は、塩基配列の決定で確認した。また、発現タンパク質の一次構造を確認するため、分子量を測定する事によっても変異の導入を確認できた。さらに、既報 (Biochem. J., 2000) に倣って、簡便なアフィニティー精製法を確立したベクター pMAL-c2(New England Biolabs) を用い、酵素タンパク質をマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質はトリプシン処理後、イオン交換クロマトによって精製SODを得る事ができた。この様な再現性の良い結果が得られた理由は、アミノ酸置換に伴う立体構造の歪みが生じなかった点が指摘できる。これにより、タンパク質の可溶性を変化させたり凝集する可能性もなく、実験成果が順調に得られた原因になっている。
これらの成果は、予備的報告として論文に纏めた（M. Komachiya 他、松本歯学　40:19-25 (2014)； M. Mihara 他、松本歯学　40:26-34 (2014) ）。

Strategy for Future Research Activity

私たちはP. g. SOD で金属寛容性を発現するアミノ酸残基：Gly-155残基を見出し、それが空間的に隣接する側鎖の協奏的作用で活性発現をしている、と考えた。そこで、近傍に位置するLeu-72、76に注目した。25種のFe型SOD中、72位はTrpが56％、76位はPheが68％を占めている。26年度の研究で、72位と76位を各々Trp、Pheに変異させ、Leuの役割を検討したところ、酵素活性は金属依存性を変える事無く、Leu-72、76の役割はP. g. SODの金属寛容性に関わる残基であると結論した。この結果、155位残基そのものに再度焦点を移し、研究の方向性を転換する事とした。現在、並行して行っている研究は、155位をAla、Ser、ValおよびTyrの変異体を作製することである。
変異体酵素は、アミノ酸置換に伴う立体構造の歪みが生じることなく、タンパク質の可溶性を変化させたり凝集する可能性もない標品を得る事が優先される。その後、活性の金属依存性を検討すべく、精製酵素を変性させながらキレート剤で金属を除去し、アポ酵素に FeあるいはMnを加え、Fe(Mn)-SODに再構成した酵素を得る。再構成酵素の吸収スペクトルと比活性を調べ、金属依存性活性の変化を検討する事を目的とし、今後の研究を展開する。

Causes of Carryover

定価購入を予定していたが、割引価格で購入し、差額代金が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度に、一般試薬の購入費として使用する。

Research Products

• [Journal Article] Effect of substituting Trp for Leu at position 72 on the structure of Porphyromonas gingivalis superoxide dismutase. (2014)
  • Author(s): Miho Komachiya, Shinya Mizoue , Masashi Mihara, Masaki Osawa, Yuichiro Kikuchi, Setsuko Uematsu, Kaname Hirai, Yuichiro Okubo, Akihiro Kuroiwa, Kazuhiro Yamada, Fumiyuki Yamakura and B.Yukihiro Hiraoka
  • Journal Title: 松本歯学 Volume: 40 Pages: 19-25
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Contribution of the amino acid residues located near the active site metal to the metal-specific activity of Porphyromonas gingivalis SOD induced by a double mutation of Leu72Trp and Leu76Phe. (2014)
  • Author(s): Masashi Mihara, Miho Komachiya, Shinya Mizoue , Masaki Osawa, Setsuko Uematsu, Yuichiro Kikuchi, Yuichiro Okubo, Kaname Hirai, Akihiro Kuroiwa, Kazuhiro Yamada, Fumiyuki Yamakura and B.Yukihiro Hiraoka
  • Journal Title: 松本歯学 Volume: 40 Pages: 26-34
  • Peer Reviewed / Open Access