2015 Fiscal Year Annual Research Report
天然型SS結合を有する分子量1万の最小レポータ蛋白質の大腸菌を用いた改変
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26560432
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
黒田 裕 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10312240)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛋白質工学 / 生物活性物質の探索 / SS結合 / 探索法 / ランダム変異 / VanX / 溶菌 / 生物発光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ガウシア・ルシフェラーゼ(以下GLuc；168残基)は、優れた最小のレポータ蛋白質となる可能性を秘めている。しかし、5本のSS結合を有するGLucの発現・精製は難しく、その構造は未知であるうえ、レポータ蛋白質としての応用も遅れている。本計画で以下の成果を得た。
１）本研究に用いることを当初予定していたGLucのN末端ドメイン（GLucの1-97残基；以下、GLucN）が弱い発光活性を有することを26年度に確認した。その後、様々な工夫を行ったにもかかわらず、発光活性は向上せず、大腸菌を宿主として発現したGLucNの収率も悪かった。その結果、GLucNの代わりに全長GLucを対象として本計画を実施することを決定した。
２）27年度には、ランダム・プライマーを用いてGLuc配列中に変異を導入し、発光波長が野生型と異なる変異体を探索（スクリーニング）した。スクリーニングには、研究代表者が先行研究で解明したVanX酵素による大腸菌の自己溶菌効果を用いた。VanXの溶菌効果を用いることで、GLucを菌体内からマイルドに抽出し、未精製状態で、培地中でスクリーニングすることを可能にした。その結果、最大発光ピークの波長が5nmレッドシフトした変異体を複数同定することに成功した。
３）最後に、核磁気共鳴法（NMR）を用いて全長GLucの構造解析を開始した。現在までに15N・13C標識したGLucを0.5mg精製し、NMR（核磁気共鳴法）測定を行った結果、主鎖原子の7割の帰属と二次構造の同定ができた。近い将来、GLucの構造を初めて明らかにできると期待する。
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