2014 Fiscal Year Research-status Report
反応性アフィニティータグを用いた蛋白質標識・精製・検出法の開発
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26560439
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
どど 孝介 独立行政法人理化学研究所, 袖岡有機合成化学研究室, 専任研究員 (20415243)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アフィニティー精製 / 蛍光標識 / ペプチド / タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ケミカルバイオロジー分野において、生物活性化合物の結合タンパク質の同定、さらにその結合部位の同定は、その作用機序解明のためには非常に重要な情報を与える。そのためには、生物活性化合物の活性を損なうことなく導入可能なタグが必要である。本研究では蛋白質標識官能基・アフィニティー精製タグ・検出官能基の３つの機能を一つのタグで併せ持つ「反応性アフィニティータグ」を開発することで、本命題の解決を目指す。これまでの研究で3つの特性のうち2つの特性を併せ持つ官能基の開発に成功している。そこで本年度はこの官能基に3つ目の機能を付加すること、さらにこれに加えて新しいタグとなる官能基を見出すことを目指し、研究を展開した。
本年度はこれまでに開発した官能基の中で標識官能基と検出官能基の機能を併せ持つ蛍光標識化タグに関して、その蛍光標識化体をペプチドに導入したものを調製し、これをモデルペプチドとしてその精製法を検討した。その結果いまだ効率は低いものの、モデルペプチドを精製する条件を見出すことに成功した。さらに、特定の金属錯体に対して錯体形成能を持つ官能基に着目し、アフィニティー精製のタグとすると同時にその反応性を利用して種々の標識官能基と反応させることを検討した。その結果、固相担持された金属錯体を用いることで、タグを有するモデルペプチドの精製に成功した。さらに蛍光団を有する標識性官能基と反応させることにも成功し、アフィニティー精製に加えて蛍光標識化も可能であることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はモデルペプチドを用いた実験系を中心に検討し、目的とする３つの機能のうち２つに関しては達成することができた。蛍光標識化タグに関しては3つ目の機能を付加することまで成功したことから、本研究のコンセプト実証の第一歩を踏み出すことができたと考えられる。また今後タンパク質へと展開するにあたって、本年度のペプチドでの検討は様々な知見を与えており、来年度に向けて全体として計画通りに進んだと考えている
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光標識化タグ、金属錯体を利用したタグ、いずれの場合もその精製効率が不十分であった。そこで次年度では精製効率を高めるべく、精製に用いる担体や精製条件のチューニングを中心にして検討を行う。その上で、蛍光標識化タグはタンパク質を用いた実験系へ進めることを目指す。また、金属錯体を利用したタグに関しては、続く蛍光標識化の反応効率向上を検討する。
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| Causes of Carryover |
モデルとなるペプチドに導入するユニットを既に研究室が保有する試薬を利用して合成することが可能であったため、新たな試薬の購入を抑えることができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は精製条件の検討を中心に行う予定であり、そのためには非常に高価な担体の購入ないしは受託による合成が必要となる。次年度使用額を合算使用することで、この費用に充てたい。
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