2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of labeling/purifying/detecting methods using a reactive affinity tag
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26560439
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 袖岡有機合成化学研究室, 専任研究員 (20415243)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アフィニティー精製 / 蛍光標識 / タンパク質 / ペプチド / 金属錯体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ケミカルバイオロジー分野において、生物活性化合物の結合タンパク質の同定、さらにその結合部位の同定は、その作用機序解明のために重要な情報を与える。そのため、生物活性化合物の活性を損なうことなく導入可能なタグが必要である。本研究では蛋白質標識官能基・アフィニティー精製タグ・検出官能基の３つの機能を一つのタグで併せ持つ「反応性アフィニティータグ」を開発することで、本命題の解決を目指す。
昨年度の検討で標識官能基と検出官能基の機能を併せ持つ蛍光標識化タグに対して、蛍光標識されたペプチドを精製するシステムを構築することに成功した。そこで本年度は本手法をより複雑な系で適用することを目指し、さらなる精製条件の最適化を試みた。その結果、複雑なタンパク質混合物中で生物活性化合物の結合タンパク質を蛍光標識化し、さらにそのサンプル中から蛍光標識部位を同定することに成功した。
さらに、昨年度見出した金属錯体に対して錯体形成能を持つ官能基に関しては、酵素阻害剤へと組み込んだプローブを用い、複雑なタンパク質混合物中で酵素の標識化とその結合部位ペプチドをアフィニティー精製できるかどうかを検討した。まず細胞抽出液を調製し、これに精製酵素を加えて化合物による酵素のラベリング、結合部位ペプチドの同定を試みた。その結果、非特異的に結合するペプチドが多くいまだ検討の余地はあるものの、精製されたペプチドの中から、酵素の触媒中心に阻害剤が結合したペプチドを同定することに成功した。
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