2014 Fiscal Year Research-status Report
新規インバースタイプのカルシウムプローブを用いた抑制性神経活動測定法の開発
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26560461
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
久下 小百合 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 学術研究員 (50260104)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | カルシウムプローブ / 神経活動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞内のカルシウム濃度の変化を可視化できる蛍光カルシウムプローブは、これまでに、種々の目的に適応した多くの蛍光カルシウムプローブが開発されてきた。しかしながら、これらのプローブはカルシウム濃度が増加することに呼応して、蛍光を発するプローブであり、神経の興奮活動を測定するのに適したものばかりであった。
そこで、神経の抑制反応を測定できるように、カルシウム濃度が減少すると蛍光を発するインバースタイプの蛍光カルシウムプローブの開発を行った。すでに報告されているインバースタイプのプローブ、インバースペリカムはカルシウム変化に伴う蛍光量の変化が小さいものであった。今回、このインバースペリカムの開発を目的に、まず、インバースペリカムをコードする遺伝子にError-Prone PCRにより、ランダムに変異を導入し、大腸菌に発現させ、カルシウムの有無により、蛍光がより大きく変化するクローンをスクリーニングした。その結果、インバースペリカム2.0, (IP2.0)を得ることに成功した。
IP2.0のタンパク質を精製したところ、in vitroにおいて、IP2.0はカルシウムの有無により、インバースペリカムより約3倍、約20倍の蛍光量の変化を示した。
さらにIP2.0をHeLa細胞に発現させ、ヒスタミン刺激を与えたところ、IP2.0の蛍光が著しく消光した。この結果はIP2.0がin vivoにおいて、細胞内カルシウム濃度の変化をモニターすることが可能なカルシウムプローブであることを示している。そこで、さらにIP2.0を線虫のAWCON神経細胞に発現させ、イソアミルアルコール刺激を与えたところ、刺激によるカルシウム濃度の減少、および刺激後のカルシウム濃度の増加を測定することが出来た。この結果はIP2.0により、神経活動の興奮のみならず、抑制反応を測定することが出来ることを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目的としていた、インバースタイプのカルシウムプローブを得ることが出来、またそれがin vivoにおいて使用可能であることが明らかとなったので、研究はおおむね、順調に進展していると思われる。
しかしながら、反応速度やヒル係数など、IP2.0の特性について、まだ明らかになっていないところが残されているので、早急にやらなくてはならないと考えている。
また、プローブとして使用していくためには、カルシウムに対する親和性が種々異なるものなど、特性に変化をもたせたプローブを作製し、どのような条件下においても使用出来るように準備しなくてはならないと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回、緑色蛍光を発するインバースタイプのカルシウムプローブを作製することに成功し、神経活動の抑制反応を測定することが可能となった。しかしながら、神経活動の機構をさらに研究していくためには抑制反応と興奮反応を同時に測定出来る系の確立が望まれる。興奮反応をモニターする緑色蛍光カルシウムプローブはすでにGCaMPをはじめ、種々のプローブが存在している。したがって、これらのプローブと併用して神経活動を観察するためには、赤色蛍光を発するインバースタイプのカルシウムプローブを開発することが望まれる。したがって、今後はmCherry等の赤色蛍光タンパク質を開発し、GCaMP等のカルシウムプローブと併用可能なインバースタイプのプローブをさくしようと考えている。
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| Causes of Carryover |
本年度、購入予定していたダイクロミラー等は研究室内の他の予算で購入したため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は赤色蛍光を発するインバースタイプのカルシウムプローブを作製する計画を立てている。そのため、赤色蛍光用のフィルター、ダイクロミラー等を購入する予定である。
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