2014 Fiscal Year Research-status Report
分子生物学と構造解析の融合によるロドプシンの究極の長波長化への挑戦
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26620005
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
井上 圭一 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90467001)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ロドプシン / 赤外分光 / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではオプトジェネティクス（光遺伝学）において高い需要がある長波長吸収型ロドプシンを作製するため、分子生物学的な手法による変異体作製と物理化学的な分子構造解析によって論理的な分子デザインを行うことを目的とする。今年度は新規長波長吸収型プロトン（H+）ポンプ型およびナトリウム（Na+）ポンプ型ロドプシンの作製を目指し、様々な野生型分子に対して変異体作製を試み、その吸収波長と活性の測定を試みた。
その内我々が2013年に新たに海洋性真正細菌から発見したNa+ポンプ型ロドプシンについてはＸ線結晶構造解析により、その分子構造を決定することに成功した（Kato et al., Nature (2015)）。これによりレチナール周辺の残基の配向を完全に明らかにすることができ、そこからシッフ塩基側の残基が特に吸収波長制御に重要であることを示唆する構造的特徴が見出された。それをもとに新たに変異体を作製したところ25 nm程度長波長シフトした分子を得ることに成功した。またさらにその活性を評価したところ野生型とほぼ同じイオンの輸送活性も保持されていることが示された。既に今年度我々は野生型Na+ポンプ型ロドプシンが、オプトジェネティクスに応用した際に強い神経の抑制能を持つことを明らかにしている。従って今回の結果はこの新規長波長吸収型Na+ポンプを用いることで、より細胞毒性の低い超波長光での抑制が可能であることが強く示唆され。今後はそれを実証するための電気生理学実験を試みる。
一方でH+ポンプ型ロドプシンについては、レチナール周辺のアミノ酸を変異させたところ予想とは逆に短波長シフトを示したが、驚くべきことにこの分子はH+チャネル型のものへと変化しており（Inoue et al., J. Am. Chem. Soc. (2015)）、今後新たなオプトジェネティクスツールとしての応用が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度H+ポンプ型ロドプシンの活性部位をNa+ポンプ型のものに変異することで、607 nmというこれまでに無い長波長吸収を示す分子の作製することに成功した。これについては残念ながらイオンの輸送活性は見られなかったが、今後さらなる変異を追加することで野生型のNa+ポンプより大幅に長波長の光で操作が可能な分子の実現を目指す。またNa+ポンプのシッフ塩基周辺の残基を変位することで、野生型と代わらない活性を保持しながら、25 nm程度吸収を長波長シフトさせることに成功した。既に今年度発表した論文（Kato et al., Nature (2015)）の中でNa+ポンプは細胞内で高い神経活動の抑制能を持つことを示したが、今回の結果はそのような光操作がより長波長の光を用いて行うことができることを強く示唆するものである。
一方でH+ポンプ型をもとにして製作を試みたNa+ポンプ型ロドプシンについては、吸収波長はこれまでロドプシン中のプロトン化シッフ塩基をもつレチナールが示すものとしては最大級に長波長シフトしたもの達成することができたが、残念がらイオンの輸送活性は見られなかった。これについては最近我々が行った構造研究により、Na+イオンの輸送にはレチナール周辺の残基だけでなく、細胞質側および細胞外側の残基も重要であることが判明していることから、これらの部分についても最適化を行う必要があると考えている。この場合レチナールの吸収に与える影響はレチナール結合部分と比して、非常に小さいと予想されることから吸収スペクトルは十分に長波長なものを維持しながら機能を持たせることが達成できるのではないかと強く期待される。
一方H+ポンプ型ロドプシンについてはレチナール周辺の残基を変異させたところ、当初予想されていたものとは逆の短波長シフトが見られた。これについては今後別の残基を変異させるなどして長波長化を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
Na+ポンプ型ロドプシンについては野生型Na+ポンプ型ロドプシンをもとにした変異体を作製することで、野生型と変わらない機能を保持したまま25 nm程度吸収波長を長波長シフトさせることに成功した。今後は電気生理学実験により、実際に神経の抑制能があるかどうかを実証していく一方で、さらなる変異によりより長波長に吸収を持たせることを試みていく。
それに対しH+ポンプ型ロドプシンをもとに作製を試みている長波長吸収型Na+ポンプ型ロドプシンについては、吸収波長は607 nmと非常に長波長側に位置するものを達成することができたが、残念ながらそれと共にイオン輸送機能が完全に失われる結果となった。今後は構造解析により明らかになった細胞外側及び内側のイオン輸送経路を構成する残基に変異を加えることで、長波長の吸収を保持したままでのイオン輸送機能の実現を目指す。
一方でH+ポンプ型ロドプシンの吸収波長制御については、今年度レチナールのβイオノン環付近の変異を加えたところ、予想と異なり吸収波長の短波長化が起こった。従って次年度以降はポリエン鎖周辺やシッフ塩基側など、レチナールと相互作用する別の部位の残基について変異を試みる。またこの短波長シフトしたタンパク質についてはこれまでにないH+を受動輸送するという、H+チャネル型の機能が新たに見出された。これについても新たなオプトジェネティクスツールとしての応用が期待されることから、今後電気生理学実験を行い、さらなる応用に向けた研究を展開していく。
そして次年度以降はCl-ポンプなど他の機能を持つロドプシンについても新たに長波長化を試み、長波長光による神経活動の制御のために最適な分子の実現に向けた研究を引き続き行っていく。これに際し新たにマイクロプレートリーダーとランダム変異導入を用いた、ハイスクリーニング系の立ち上げも試みる。
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[Journal Article] Structural Basis for Na+ Transport Mechanism by a Light-Driven Na+ Pump2015
Author(s)
H. E. Kato, K. Inoue, R. Abe-Yoshizumi, Y. Kato, H. Ono, M. Konno, T. Ishizuka, M. R. Hoque, S. Hososhima, H. Kunitomo, J. Ito, S. Yoshizawa, K. Yamashita, M. Takemoto, T. Nishizawa, R. Taniguchi, K. Kogure, A. D. Maturana, Y. Iino, H. Yawo, R. Ishitani, H. Kandori, O. Nureki
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Journal Title
Nature
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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