2015 Fiscal Year Research-status Report
アルカンの水酸化を触媒するミオグロビン創製への挑戦
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26620045
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20222226)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ミオグロビン / マンガンポルフィセン / 水酸化反応 / 人工生体触媒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チトクロムP450は不活性C(sp3)-H結合の活性化を介した水酸化反応の触媒として働くヘム酵素として広く生体内に存在する。一方、酸素分子の貯蔵をつかさどるミオグロビンは同じ補因子ヘムを有するものの、水酸化反応に対する触媒活性を全く示さない。本研究ではミオグロビンの補因子ヘムの非天然ヘムへの置換とヘムポケットの変異を施し、酸素貯蔵機能タンパク質から、過酸化水素を酸化剤として駆動するアルカンの水酸化反応触媒への機能変換に挑戦する。この研究を通じて、錯体化学の観点から水酸化反応の触媒活性に必要な因子を把握し、メタルオキソ種を経由するC-H結合の活性化反応機構を改めて検証する。さらに、MD計算結果をもとに、遺伝子工学手法に基づくヘムポケットの立体構造の改変を通じて、エナンチオ選択的アルコールの合成が目標である。
昨年度（平成２７年度）は、引き続きミオグロビンの人工補欠分子としてマンガンポルフィセンを選び、その合成とアポミオグロビンへの挿入、および得られた再構成タンパク質の同定と構造解析を実施した。特に、ミオグロビンのヘムポケットの幾つかの箇所にアミノ酸の変異導入を遺伝子工学的に実施し、基質のエナンチオ選択的水酸化を試みた。 特にエチルベンゼンを基質として、生成物の1-ヒドロキシエチルベンゼンの光学活性(ee%)について、詳細な評価を行った。 生成物の光学活性は、ヘムポケットのアミノ酸残基の配置に大きく依存し、アルコールのキラル中心も、変異導入の様式によってR体、S体のそれぞれの立体配座が得られた。 基質のヘムポケット内への接近をMD計算を用いて見積もった結果は、実際に得られた光学活性とある程度の相関も得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、ミオグロビンの人工補欠分子であるマンガンポルフィセンの合成、アポミオグロビンへの挿入と再構成タンパク質の調製を行った。さらに、この再構成ミオグロビンが、水酸化反応を触媒するチトクロムP450酵素と同様の補因子を有するミオグロビンでありながら困難とされてきた外部基質の水酸化反応を初めて達成した。さらに、触媒回転率は、それほど高くないが、P450酵素反応機構として提唱されている触媒的な基質の不活性結合(C(sp3)-H結合)の活性化と、水素引き抜きをともなう水酸化反応をミオグロビンヘムポケット内で展開できた。さらに、昨年度（平成２７年度）は、得られるアルコール生成物の光学純度をキラルカラムを装着したガスクロマトグラフィーによって求めた。 特に、基質が結合するヘムポケット（遠位側）の構造に起因したエナンチオ選択的アルコール生成に焦点をあて、幾つかのアミノ酸の変異導入を行い、それぞれのミオグロビン変異体におけるアルコール生成物の光学活性を算出した。 エチルベンゼンを基質とした場合、1-ヒドロキシエチルベンゼン生成物は、天然のミオグロビンを触媒とした際には、15%ee(S)であるが、His64をAla64に置換すると、48%eeで、立体配座もS体からR体に変化した。一方、His64はそのまま残し、Phe43をAlaに、Val68をPheに変換すると、50%ee(S)が得られた。 さらに、Ala43/Ile64/Phe68トリプル変異体を用いると、69%ee(S)までエナンチオ選択的にアルコールが生成した。 これらの結果は、別途MD計算から求めたヘムポケットへの基質結合の安定性とある程度の相関があり、基質が着実にヘムポケットに結合した状態で、水酸化反応が進行することが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開としては、有益な生体触媒創製をめざし、得られたマンガンポルフィセンを補因子とする再構成ミオグロビンを用いた、様々な基質の水酸化を実施する。 特に、種々のアルカン（ヘキサン、分岐ヘキサン、さらには炭素数の少ない、ブタン、プロパン、エタン、そして究極的にはメタン）の水酸化に挑戦する。 また、現時点では、まだ活性は十分とは言えないため、水酸化反応の活性を上げるため、ヘムポケット内に存在する幾つかのアミノ酸に対する変異導入と、補因子側のポルフィセンの活性を向上させるためのポルフィセン骨格への置換基導入、あるいはポルフィセン以外のポルフィリノイドを配位子とする金属錯体を有するミオグロビンでの水酸化を検討する。
また、一昨年・昨年度から継続して、活性種の同定、厳密な反応機構の解明に努めたい。特に、ストップドフロー装置を用いた反応中間体（メタルオキソ種）の検出と、その構造および反応性の評価をUV-visや結晶構造解析、EPR測定などを駆使して今後実施を試みる。得られる成果から、どのような人工補因子が最適であるかを模索し、補欠分子のさらなる分子設計を実施する。
以上、最終的には、タンパク質をもちいた触媒の優位性を示し、不活性C-H結合の活性化を伴う炭化水素の水酸化と生成物の立体制御に取り組み、将来的に有用な触媒につながる方策を示すことに努力したい。
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| Causes of Carryover |
昨年度、活性中間体の同定に関する実験データが予想していた当初の化学種でないことが判明し、活性中間体の多角的な評価が必要になり、研究遂行に時間を要し、また、国際共同研究として実施していた理論計算の再検討が必要になったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記で示したように、高酸化活性種中間体の測定に必要な試薬、機器および計算に必要な費用、またこれらによって得られる成果の発表のための学会・国際会議出張や論文の添削費用に使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
