2014 Fiscal Year Research-status Report
単一細胞のRNAおよびDNA同時抽出・解析技術の開発
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26630052
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
新宅 博文 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (80448050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小寺 秀俊 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20252471)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 動電現象 / 等速電気泳動法 / DNA / RNA / タンパク / PCR / マイクロ流体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は一細胞からcytoplasmic RNAおよびgenomic DNAを同時に抽出・分離するマイクロ流体システムを構築した．また，マイクロ流体システムから出力されたcytoplasmic RNAおよびgenomic DNAのそれぞれの品質についてRT-qPCR (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)およびqPCRを用いた解析を行った．本解析から，RNAサンプルにおけるgenomic DNAの混入量はqPCRの検出限界以下であり，抽出したRNAの純度が非常に高いことがわかった．また，house keeping geneをターゲットとしたRT-qPCR解析から，抽出したRNA分子のほとんどがPCRで増幅できる程度にはintegrityを保っており，我々の開発した方法が様々な解析に応用できる可能性を示した．我々の開発したマイクロ流体システムは，細胞膜の溶解を200 ms，抽出および分離を約1 分程度で完了させることが可能であり，本高速分離抽出技術により比較的不安定なRNA分子の品質を保てているものと考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
一細胞からcytoplasmic RNAおよびgenomic DNAを同時に分離・抽出・精製するマイクロ流体システムの開発に成功し，出力されたRNAおよびDNAの品質が様々なダウンストリーム解析に対して適用可能であることがわかった．本技術はマイクロ流体工学の研究者のみならず，geneticsおよびmedicine等の分野の研究者からも注目を集めており，我々の技術を基盤とする共同研究をすでにスタートさせている．具体的にはRNA-seqおよびDNA-seq等の網羅的解析技術とのパイプラインプロトコールを開発し，臨床サンプルを用いた技術の実証試験を試験的に実施している．
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| Strategy for Future Research Activity |
RNA-seqおよびDNA-seqとのパイプラインプロトコールの最適化を行い，低コピー数の遺伝子についても検出可能なマイクロ流体システムを開発する．これには，on-chipでmRNAの精製，逆転写を行う技術の開発を計画している．特に逆転写のプロセスはサンプルの温度を上昇させ，酵素反応を促進する必要があり，その条件においてpH，溶液粘度，電気浸透流等が変化することが予想され，マイクロ流体システム内部の詳細流動の解析を進めながら，上記技術開発に取り組む．
一方で，on-chipで遺伝子発現解析を行う方法論の確立についての検討も予定しており，逆転写およびサンドイッチ法を組み合わせた方法を計画している．特に検出感度の向上が技術的な課題と考えられるが、高倍率の対物レンズとの整合性が高いマイクロ流体システムを製作することでこれを可能にする予定である．また，サンドイッチ法と融合するためのシステム設計も行う予定である．
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