2015 Fiscal Year Annual Research Report
バイオ医薬品の活性維持を目的とした凍結タンパク質水溶液のin-situ評価
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26630066
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
高松 洋 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20179550)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藏田 耕作 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00368870)
福永 鷹信 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 技術職員 (60591196)
Wang Haidong 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30729405)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 凍結保存 / バイオ医薬品 / ラマンイメージング / タンパク質変性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は，①方向性凝固低温ラマン顕微鏡システムを用いて凍結実験を行い，氷やタンパク質の分布に及ぼす凍結条件の影響を明らかにするとともに，②タンパク質変性の定量的評価を行った．
①については，26年度に製作した方向性凝固ステージをレーザーラマン顕微鏡に組み込んだ装置を用いて実験を行った．試料を置いた両側のステージに温度差を与え，植氷用チャネルにヨウ化銀を一滴落として凍結を開始させた．凍結完了後，凍結開始位置から凍結終了位置まで顕微鏡のステージを移動させて，全範囲のラマン分光データを取得し，ラマンイメージング像を得るとともにデータの定量化を行った．試料には，濃度の異なるリゾチームとトレハロースを混合した水溶液を用いた．しかしながら，2つの溶質のスペクトルピークが重なる問題が生じた．そこで，Amide IとCHの2つのピークを用いて，凍結試料中に分散するそれぞれの溶質の濃度を算出する方法を開発した．実験の結果，リゾチームとトレハロースが共局在していること，トレハロースの濃度が水溶液とリゾチームの動態に影響すること，トレハロースの添加がリゾチームの濃縮を抑制して凍害防御効果に繋がっている可能性のあることなどを明らかにした．
②については，リゾチームのAmide Iバンドが変性によって低波数側にシフトすることに着目して評価を行った．その結果，リゾチーム単溶質の試料では凍結後に変性（Amide Iバンドの低波数側シフト）が認められ，特に凍結界面の進行速度が遅い領域でその変性は顕著であった．また，界面進行速度が速い領域においては，トレハロース添加によってその変性が抑制されることを明らかにした．本実験によって，凍害防御効果を期待できるトレハロース添加濃度と界面進行速度の範囲を示すことができた．
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