2015 Fiscal Year Research-status Report
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26630426
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
堀 克敏 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50302956)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松浦 友亮 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50362653)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ナノバイオ / バイオテクノロジー / 蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、研究代表者らが高付着性細菌Acinetobacter sp. Tol 5細胞上に発見した、付着性バクテリオナノファイバー（AtaA）の遺伝子をリポソーム内部で合成し、AtaA被毛リポソームを創製することである。AtaAは3630アミノ酸から成る巨大なタンパク質であるため、発現やフォールディングに困難が伴うと予想される。そこで我々は昨年度までに、AtaAの構造を損なわない縮小版AtaA （IFD-CPSD）を設計、構築し、無細胞タンパク質合成系（ピュアシステム）でポリペプチド鎖が合成できる事を確認した。27年度は、縮小版AtaAをリポソーム表層に発現させることを目指し、以下の検討を行った。
1. 縮小版AtaAの最適化:昨年度作成したIFD-CPSDは、ピュアシステム合成時、構造の一部に亀裂が入り切断する可能性がある事がわかった。そこで我々はドイツのマックスプランク研究所との共同研究に基づく成果をもとに、正しいフォールディング状態を保つ新たな縮小版AtaA（IFD-43）を作成した。
2. リポソーム内での発現:作成したIFD-43を、遠心沈降法により調整した細胞サイズのジャイアント・シングルラメラ・リポソーム内部で合成し、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリ－により、抗体蛍光標識したIFD-43が表層提示されている事を確認した。
3. リポソーム表層提示の最適化:リポソーム内で合成したタンパク質の表層提示量は、様々な要因により左右される。表層提示量の向上のため、添加するDNA量、リポソーム内でのピュアシステム合成時間の最適化を行い、表層提示量の向上に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
リポソーム内部でAtaAファイバーを合成し、表層に提示されることをフローサイトメトリで確認し、26年度に達成できなかった、リポソーム内でのAtaAファイバーの合成を今年度は達成することができた。AtaAのようなファイバータンパク質をリポソーム表層へ提示する事は世界初の成果である。しかしながら、26年度のもう一つの目標であるファイバー形成能の検討について、表層に提示されたAtaAファイバーが正しい構造をとる必要があるが、まだ確認できていない。一方、27年度の当初目標である表層提示の最適化については、概ね達成された。したがって、やや遅れていると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
AtaAファイバーが正しくフォールディングされている事を明らかにする。具体的には、電子顕微鏡やAFMによる観察、あるいはAtaAファイバー上にGFPやHaloタグ（蛍光リガンドと結合するタンパク質）などを提示して確認する予定である。これら方法により正しいフォールディングが確認できれば、世界初の被毛性リポソームができたことになり、本研究の目的は達成できたと言える。
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| Causes of Carryover |
27年度で終了予定であったが、当初の予想をはるかに上回る結果が出ているため、28年度も実験が必要と考え、補助事業期間の延長をし、研究を継続するため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度は、電子顕微鏡やAFMなどでの観察を計画しており、観察試料作製のための試薬などの購入に充てる予定である。
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Research Products
(2 results)
