抑制性のシナプス学習過程を検出可能な新規シナプスクロライドプローブの開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26640002
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 大倉 正道 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (70369172)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 神経科学 / 神経活動 / 抑制性シナプス / クロライドプローブ / 蛍光イメージング

Outline of Annual Research Achievements

神経細胞の個々のシナプスへの興奮性入力による興奮性シナプス後電位（EPSP）と抑制性入力による抑制性シナプス後電位（IPSP）は時に可塑性を示しながら統合され、電気緊張電位として伝わり活動電位を発生させる。シナプスでの統合をより深く理解するためにはイオンの動きと膜電位の可視化が重要となる。IPSPは一過性に細胞内Cl-濃度上昇を起こすが、これまでIPSPによるCl-上昇は可視化されていない。本研究は、IPSPの可視化を目指し、高感度で高い反応性を備えた蛍光Cl-プローブを開発し、抑制性のシナプス可塑性(iLTP)を可視化により解明することを目的としている。26年度は、Cl-結合蛋白質をCl-感受性素子として活用しながら、我々独自の改変GFP cDNAを基にCl-プローブのプロトタイプを遺伝子工学的に多数試作した。試作したプローブは大腸菌に発現させて蛋白精製し、蛍光分光光度計および分光光度計を用いてCl-応答性や光学特性を解析した。その結果、Cl-濃度変化での蛍光変化量が大きいプローブを数種類見出すことができた。蛍光変化量が大きいプローブは培養神経細胞に発現させ、GABA受容体やグリシン受容体の刺激での蛍光応答の大きさを指標として細胞での性能を評価した。現在得られつつある有望なプローブは、PCRを用いたrandom mutagenesisによりそのcDNAに変異導入を行い、改良を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Cl-濃度変化での蛍光変化量が大きいプローブの開発がおおむね順調に進んでいるため。

Strategy for Future Research Activity

今後も反応性に優れたCl-プローブの開発を継続し、モデル動物の抑制性シナプスに応用することで抑制性のシナプス学習過程を検出できるか検討する。

Research Products

• [Journal Article] Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. (2015)
  • Author(s): Inoue M, Takeuchi A, Horigane SI, Ohkura M, Gengyo-Ando K, Fujii H, Kamijo S, Takemoto-Kimura S, Kano M, *Nakai J, *Kitamura K, *Bito H
  • Journal Title: Nature Methods Volume: 12 Pages: 64-70
  • DOI: 10.1038/nmeth.3185
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Water-soluble jack-knife prawn extract inhibits 5-hydroxytryptamine-induced vasoconstriction and platelet aggregation in humans. (2015)
  • Author(s): Gamoh S, Kanai T, Tanaka-Totoribe N, Ohkura M, Kuwabara M, Nakamura E, Yokota A, Yamasaki T, Watanabe A, Hayashi M, Fujimoto S, *Yamamoto R
  • Journal Title: Food Funct Volume: 6 Pages: 444-449
  • DOI: 10.1039/C4FO00716F
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reward-timing-dependent bidirectional modulation of cortical microcircuits during optical single-neuron operant conditioning. (2014)
  • Author(s): Hira R, Ohkubo F, Masamizu Y, Ohkura M, Nakai J, Okada T, *Matsuzaki M
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 5:5551 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/ncomms6551
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. (2014)
  • Author(s): Suzuki J, Kanemaru K, Ishii K, Ohkura M, Okubo Y, *Iino M
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 5:4153 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1038/ncomms6551
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 高感度、超高速赤色カルシウムインディケーターの合理的設計による開発. (2015)
  • Author(s): 井上昌俊, 竹内敦也, 堀金慎一郎, 大倉正道, 安藤恵子, 藤井哉, 上條諭志, 竹本-木村さやか, 狩野方伸, 中井淳一, 喜多村和郎, 尾藤晴彦
  • Organizer: 第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-21 – 2015-03-23
• [Presentation] マウス皮質において正確な知覚に必要なトップダウン制御のメカニズム. (2015)
  • Author(s): 真仁田聡, 鈴木崇之, 本間千尋, 松元崇, 小田川摩耶, 山田一之, 太田桂輔, 松原智恵, 犬束歩, 佐藤正晃, 大倉正道, 山中章弘, 柳川右千夫, 中井淳一, 林康紀, Matthew E. Larkum, 村山正宜
  • Organizer: 第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-21 – 2015-03-23
• [Presentation] 海馬CA1における価値表現の選択的保持. (2015)
  • Author(s): 水田恒太郎, 佐藤正晃, 関根友紀子, 河野真子, イスラムタンビル, 大倉正道, 中井淳一, 林康紀
  • Organizer: 第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-21 – 2015-03-23
• [Presentation] 高感度、超高速赤色カルシウムインディケーターの合理的設計による開発. (2015)
  • Author(s): 井上昌俊, 竹内敦也, 堀金慎一郎, 大倉正道, 安藤恵子, 藤井哉, 上條諭志, 竹本-木村さやか, 狩野方伸, 中井淳一, 喜多村和郎, 尾藤晴彦
  • Organizer: 第88回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-03-18 – 2015-03-20
• [Presentation] タンパク質型Ca2+インジケーターCEPIAを用いた小胞体・ミトコンドリア内腔Ca2+動態の可視化と機能解析. (2015)
  • Author(s): 鈴木純二, 金丸和典, 石井邦明, 大倉正道, 大久保洋平, 飯野正光
  • Organizer: 第88回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-03-18 – 2015-03-20
• [Presentation] 蛍光カルシウムタンパクG-CaMPによるin vivoカルシウムイメージング. (2014)
  • Author(s): 中井淳一, 大倉正道, 安藤恵子
  • Organizer: 東京理科大学総合研究機構イメージングフロンティア研究部門 2014年度シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京理科大学野田キャンパス（千葉県野田市）
  • Year and Date: 2014-12-20 – 2014-12-20
  • Invited
• [Presentation] 個体（線虫）レベルでの超多並列刺激応答モニターシステム (2014)
  • Author(s): 藤泰一, 高橋尚也, 安藤恵子, 大倉正道, 中井淳一, 西垣功一
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] Imaging deep-layer neuronal activity in mouse barrel cortex using 1040-nm excitation of a red fluorescent-protein calcium indicator. (2014)
  • Author(s): Carta S, Chen J, Voigt F, Schneider B, Ohkura M, Nakai J, Helmchen F
  • Organizer: Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: Walter E. Washington Convention Center（Washington DC, USA）
  • Year and Date: 2014-11-15 – 2014-11-19
• [Presentation] A comparative study of the two-photon performance of GCaMPs and GECOs. (2014)
  • Author(s): Podor B, Zhao Y, Wu J, Hu Y, Ohkura M, Nakai J, Campbell R, Croll R, Fine A
  • Organizer: Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: Walter E. Washington Convention Center（Washington DC, USA）
  • Year and Date: 2014-11-15 – 2014-11-19
• [Presentation] 神経細胞内局所カルシウム動態の可視化を目指した高感度シナプスカルシウムプローブG-CaMP6-actinの応用. (2014)
  • Author(s): 大倉正道, 小林千晃, 貞苅純子, 佐々木拓哉, 池谷裕二, 中井淳一
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] Visualization of cerebral calcium dynamics by a transgenic mouse that express G-CaMP7 in neurons and glia. (2014)
  • Author(s): Monai H, Ohkura M, Tanaka M, Itohara S, Nakai J, Iwai Y, Hirase H
  • Organizer: 第37回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] Single-neuron operant conditioning by two-photon imaging induces reward-timing-dependent modulation in cortical microcircuit. (2014)
  • Author(s): Hira R, Ohkubo F, Masamizu Y, Ohkura M, Nakai J, Okada T, Matsuzaki M
  • Organizer: 第37回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] 大脳皮質におけるトップダウン回路の構造と機能. (2014)
  • Author(s): 真仁田聡, 鈴木崇之, 本間千尋, 松元崇, 小田川摩耶, 山田一之, 太田桂輔, 松原智恵, 犬束歩, 佐藤正晃, 大倉正道, 山中章弘, 柳川右千夫, 中井淳一, 林康紀, Matthew E. Larkum, 村山正宜
  • Organizer: 第37回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] ホヤ幼生の遊泳運動神経回路の構造と生理機能の解析. (2014)
  • Author(s): 堀江健生, 大倉正道, 日下部岳広, 中井淳一, 中川将司
  • Organizer: 日本動物学会第85回大会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] 細胞触覚センサのための小型蛍光観察システムの開発. (2014)
  • Author(s): 民山浩輔, 清水正宏, 宮坂恒太, 小椋利彦, 中井淳一, 大倉正道, 細田耕
  • Organizer: 第32回日本ロボット学会学術講演会
  • Place of Presentation: 九州産業大学（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2014-09-04 – 2014-09-06
• [Presentation] Ca2+イメージング. (2014)
  • Author(s): 大倉正道
  • Organizer: 第39回組織細胞化学講習会
  • Place of Presentation: ピアザ淡海（滋賀県大津市）
  • Year and Date: 2014-08-06 – 2014-08-08
  • Invited
• [Presentation] Cerebral blood flow modulation by basal forebrain or whisker stimulation can occur independently of large cytosolic Ca2+ signaling in astrocytes. (2014)
  • Author(s): Oe Y, Ozawa K, Takata N, Nagai T, Konno A, Ohkura M, Hirai H, Nakai J, Mikoshiba K, Hirase H
  • Organizer: 9th FENS Forum of Neuroscience
  • Place of Presentation: MiCo （Milan, Italy）
  • Year and Date: 2014-07-05 – 2014-07-09
• [Presentation] Single-neuron operant conditioning by two-photon imaging induces reward-timing-dependent biderectional modulations in cortical microcircuit. (2014)
  • Author(s): Hira R, Ohkubo F, Masamizu Y, Ohkura M, Nakai J, Okada T, Matsuzaki M
  • Organizer: 9th FENS Forum of Neuroscience
  • Place of Presentation: MiCo （Milan, Italy）
  • Year and Date: 2014-07-05 – 2014-07-09
• [Presentation] Imaging subcellular Ca2+ dynamics of neurons with a highly responsive genetically encoded Ca2+ indicator. (2014)
  • Author(s): Ohkura M, Kobayashi C, Sadakari J, Sasaki T, Ikegaya Y, Nakai J
  • Organizer: 9th FENS Forum of Neuroscience
  • Place of Presentation: MiCo （Milan, Italy）
  • Year and Date: 2014-07-05 – 2014-07-09
• [Book] 高感度Ca2+プローブG-CaMPを用いた脳内シナプス活動のイメージング.『脳内環境-恒常性維持機構の破綻と病気』 (2014)
  • Author(s): 大倉正道, 中井淳一
  • Total Pages: 220（108-113）
  • Publisher: （株）メディカルドゥ
• [Book] Ca2+イメージング.『組織細胞化学2014』 (2014)
  • Author(s): 大倉正道, 中井淳一
  • Total Pages: 230（161-168）
  • Publisher: 日本組織細胞化学会
• [Remarks] 埼玉大学 研究機構 脳末梢科学研究センター
  • URL: http://subsi.saitama-u.ac.jp/
• [Patent(Industrial Property Rights)] カルシウム指示遺伝子 (2014)
  • Inventor(s): 尾藤晴彦, 井上昌俊, 竹内敦也, 中井淳一, 大倉正道
  • Industrial Property Rights Holder: 独立行政法人科学技術振興機構
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2014-120828
  • Filing Date: 2014-06-11