2014 Fiscal Year Research-status Report
膜電位存在下での膜タンパク質の赤外分光解析系の開発
| Project/Area Number |
26640047
|
|---|
| Research Institution | Institute for Molecular Science |
|---|
Principal Investigator |
古谷 祐詞 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 准教授 (80432285)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 赤外分光法 / 生物物理 / 膜タンパク質 / 膜電位 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質は、細胞外の環境情報を細胞内に伝達するなどの役割を果たしている。その分子機構の解明には、原子レベルでの構造情報を得ることが重要である。静的な立体構造についてはX線結晶構造解析によってなされているが、膜電位がどのように構造に影響するのかなど不明な点が多い。パッチクランプ法などの電気生理解析では、様々な膜電位におけるイオンチャネルの機能解析が可能であるが、構造に関する情報を得ることは困難である。
本研究では、膜タンパク質の赤外吸収スペクトルを高感度に計測する顕微赤外分光計測法を開発し、膜電位存在下での膜タンパク質の動的構造変化の計測系を構築することを目指している。研究項目として、１、高感度顕微赤外分光装置の開発、２、膜タンパク質の分子機構解明に向けた研究の２項目を設定している。今年度は、１に関連して、表面増強赤外分光計測に適した金薄膜の形成条件を確認した。それに関連して、GroELタンパク質の構造転移に関する共著論文の発表に寄与した（J. Chen et al. Sci. Rep. 2014）。
２のテーマに関連して、電気生理実験で用いられているデータ取得装置であるMolecular Devices 社のDigidata 1550を新規に導入した。精製タンパク質が機能的であるかどうかを確認する１つの手法として、平面脂質二重膜による電気生理実験があるが、それに向けた動作確認を行った。また、ほ乳動物由来のカリウムチャネルの一種であるTWIK-1に関して、全反射赤外分光計測によって得られたアルカリ金属イオンとの相互作用の解析データについて、結晶構造解析との比較などから、特異な相互作用に関する知見を得た。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜タンパク質の赤外吸収スペクトルを高感度に計測する顕微赤外分光計測に向けた準備を順調に進めており、膜タンパク質の機能解析に必要となる電気生理実験の計測系の準備も順調である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）高感度顕微赤外分光装置の開発
赤外顕微鏡に設置されたATR対物鏡の表面に、膜タンパク質を脂質二重膜に再構成した試料を吸着させて、赤外吸収スペクトルの計測を行う。どれぐらいの濃度での計測が可能かを検討する。また、ATR対物鏡やガラス基板上に金薄膜を蒸着し、膜タンパク質を表面に修飾する。膜タンパク質由来の赤外吸収シグナルの増強を目指すと共に、最適な増強効果が得られる条件を模索する。
２）膜タンパク質の分子機構解明に向けた研究
平成26年度に引き続き、培養細胞により種々の膜タンパク質発現を行う。また、精製タンパク質の脂質二重膜への再構成方法を、それぞれの試料に応じて検討する。精製タンパク質が機能的であるかどうかを平面脂質二重膜による電気生理実験などで確認する。全反射赤外分光計測により、イオンやリガンドなどの結合解離に伴う構造変化を明らかにし、基礎データとして活用する。
|
| Causes of Carryover |
Molecular Devices社のDigidata 1550を他の研究にも利用できるように共用利用とし、本基金での購入費用を抑えることができた。また、赤外分光測定に使用する試薬や膜タンパク質の調製に必要となる試薬や培地などを節約した。以上の理由により、今年度に必要な研究費を当初の予定よりも少なくすることができたため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度必要となる赤外分光測定に使用する試薬や膜タンパク質の調製に必要となる試薬や培地に使用する予定である。
|
