2015 Fiscal Year Research-status Report
膜電位存在下での膜タンパク質の赤外分光解析系の開発
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26640047
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
古谷 祐詞 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 准教授 (80432285)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 赤外分光法 / 生物物理 / 膜タンパク質 / 膜電位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質は、細胞外の環境情報を細胞内に伝達するなどの役割を果たしている。その分子機構の解明には、原子レベルでの構造情報を得ることが重要である。静的な立体構造についてはX線結晶構造解析によってなされているが、膜電位がどのように構造に影響するのかなど不明な点が多い。パッチクランプ法などの電気生理解析では、様々な膜電位におけるイオンチャネルの機能解析が可能であるが、構造に関する情報を得ることは困難である。
本研究では、膜タンパク質の赤外吸収スペクトルを高感度に計測する顕微赤外分光計測法を開発し、膜電位存在下での膜タンパク質の動的構造変化の計測系を構築することを目指している。研究項目として、１．高感度顕微赤外分光装置の開発、２．膜タンパク質の分子機構解明に向けた研究の２項目を設定している。今年度は、１．に関連して、表面増強赤外分光計測により、カリウムイオンやナトリウムイオンを選択的に吸着するクラウンエーテルのイオン包摂に伴う赤外吸収スペクトル解析の結果を共著論文として発表した（Y. Inokuchi et al. New J. Chem. 2015）。タイのチュラロンコン大学のインターンシップ生とともに、電気化学計測に用いるポテンシオスタットをマイクロ流路に組み込まれた電極に接続し、フェリシアン化カリやシトクロムcなどの酸化還元に伴う赤外吸収スペクトルの変化を赤外顕微鏡で計測することに成功した。表面増強赤外分光と組み合わせることで、電位依存的な赤外吸収変化を計測するための予備的な実験にもなりうるものである。
２．のテーマに関連して、ほ乳動物由来のカリウムチャネルの一種であるTWIK-1のイオン選択性に関する解析を進めたり、GPCRの一種であり視物質ロドプシンと近縁なメラノプシンの分子特性に関する結果を共著論文として発表した（H. Tsukamoto et al. J. Biol. Chem. 2015）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
膜タンパク質の赤外吸収スペクトルを高感度に計測する顕微赤外分光計測赤外分光計測系の構築や膜タンパク質の機能解析に必要となる電気生理実験の計測系の構築に若干の遅れが見られる。一方、プロトン感受性蛍光標識ACMAを用いたイオンチャネル活性測定系については若手研究(A)との関連も有り、順調に進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．高感度顕微赤外分光装置の開発 赤外顕微鏡に設置されたATR対物鏡を用いて、脂質二重膜に再構成した膜タンパク質試料の赤外吸収スペクトルの計測を行う。どれぐらいの濃度での計測が可能かを検討する。また、ガラス等の基板上に金薄膜を蒸着し、膜タンパク質を表面に修飾する。膜タンパク質由来の赤外吸収シグナルの増強を目指すと共に、最適な増強効果が得られる条件を模索する。
２．膜タンパク質の分子機構解明に向けた研究 前年度に引き続き、培養細胞により種々の膜タンパク質発現を行う。また、精製タンパク質の脂質二重膜への再構成方法を、それぞれの試料に応じて検討する。精製タンパク質が機能的であるかどうかを平面脂質二重膜による電気生理実験などで確認する。全反射赤外分光計測により、イオンやリガンドなどの結合解離に伴う構造変化を明らかにし、基礎データとして活用する
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| Causes of Carryover |
赤外分光測定に使用する試薬、膜タンパク質の調製に必要となる試薬や培地などを節約した。以上の理由により、今年度に必要な研究費を当初の予定よりも少なくすることができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度必要となる赤外分光測定に使用する試薬や膜タンパク質の調製に必要となる試薬や培地に使用する予定である。
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