2014 Fiscal Year Research-status Report
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26640050
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
八神 健一 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40166476)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 助教 (10633141)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / マウスES細胞 / Y染色体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集を利用する遺伝子改変マウスの作製はその簡便性と迅速さから多くの施設で行われるようになった。受精卵への人工制限酵素(TALENやCRISPR/Cas9)とドナーベクターの共導入によるノックインマウス作製は、ES細胞を用いるよりも迅速でありかつ生殖系列へ確実な移行が担保されている点で優れているが、そのノックイン効率は高くなく目的のマウスが得られない問題がある。一方で、マウスES細胞内にて行われるゲノム編集は、長い時間が必要であるが、非常に高い効率でのノックインが可能であり、目的の変異を持たないマウスが誕生してしまう可能性が非常に少ないため動物実験の3RのReductionに大きく貢献する。
そこで、Y 染色体に自殺遺伝子または蛍光レポーター遺伝子を導入することで、多重の変異遺伝子を有する1つのES細胞(XYi-ESc)から雌雄両方のマウスを作出する方法の確立を試みた。
まず、26年度で、Y 染色体へ自殺遺伝子(iCaspase3)または蛍光レポーター遺伝子(EGFP)をノックインするためターゲティングベクターの構築を行った。次に、この2種類のベクターを我々が樹立したC57BL/6J系統のES細胞にそれぞれ導入した。なお、Y染色体へのノックインは古典的な遺伝子ターゲティングでは、困難であるため、ニッケースのCRISPR/Cas9システムを利用した。その結果、非常に高い効率でのノックインが認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、Y染色体に自殺遺伝子もしくは蛍光レポーター遺伝子がノックインされたマウスES細胞の樹立に成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度に樹立したXYi-ES細胞を中期間培養することでY染色体が脱落したES細胞(XO-ES)細胞を出現させ、自殺遺伝子もしくは蛍光レポーターによりこれを選別する。次にXYi-ES細胞とXO-ES細胞から個体を作製し、ひとつのES細胞から雌雄両方のマウスが誕生する方法を確立する。
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