CRISPR/CASシステムを用いたミトコンドリア遺伝子改変技術の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26640056
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: CRISPR/Cas / 実験動物 / ノックアウト / 点変異 / ノックイン / 不妊

Outline of Annual Research Achievements

『目的』最新の標的遺伝子組換え技術であるCRISPR/CASシステムを活用することで、これまで不可能とされたミトコンドリアDNA (mtDNA) の標的遺伝子組換え技術を開発する。さらに、その応用としてミトコンドリア病の疾患モデル作製を目指す。なお開発した遺伝子組換え技術および動物は、公的機関を通して広く生命科学研究者に提供する。
『実施概要』以下の２つを柱に研究を進めた。
I.ミトコンドリア標的CAS9の開発：現在、汎用されるCAS9はゲノムDNAを組換えることを目的に作られているため、N末とC末の両端に核移行シグナルが付加されていた。そこでpX330をベースに、ミトコンドリア移行シグナル付きCAS9と、標的配列を認識するsgRNAを同時に発現するpX330mtを構築した。
II.ミトコンドリア遺伝子組換えシステムの開発：mtDNAのサイズは全長で約16,500塩基と小さく、37遺伝子しかコードされていない。本課題では、ヒトとマウスで良く保存されているND5 (NADHデヒドロゲナーゼ) を標的としてmtDNAを組換えることを試みたが、標的部位が切断されたESクローンが得られなかった。