2014 Fiscal Year Research-status Report
ハプロイドES細胞を用いたiPS細胞生成過程の制御因子の探索
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26640062
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
堀江 恭二 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / ゲノム / 再生医学 / バイオテクノロジー / 発生・分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ハプロイドゲノムを有すマウスES細胞を用いて、iPS細胞の生成効率を高める遺伝子変異を同定することを目指している。このために、まずはハプロイドES細胞に対して、ジーントラップ法でゲノムワイドな変異を導入し、その後、ES細胞をEpiSCへ分化誘導し、さらに、EpiSCからiPS細胞へ初期化させ、初期化の効率に影響を与える遺伝子変異を同定する。しかし、ハプロイドES細胞はある一定の頻度でディプロイド化し、これが実験の効率に大きく影響した。ゲノムワイドに遺伝子を破壊するためには、相当数のハプロイドES細胞を用いる必要がある。そこで、ヘキスト染色後にUVレーザーを用いたFACS sortingを行ってハプロイドのDNA量の細胞を回収するのだが、十分な生存細胞を安定的に取得するのが容易ではなかった。一方、本研究課題では、ハプロイドES細胞でスクリーニングしてきた遺伝子をCRISPR/Casシステムで迅速に破壊して、その機能を確定させることを計画していたが、この点については、ES細胞において、タモキシフェン添加によりCas9の発現を簡便に誘導する実験系を開発し、順調に進展しつつある。CRISPR/Casシステムにおいては、最近、ゲノムワイドに遺伝子破壊をするためのguide RNAライブラリが開発された。そこで、上述のCas9誘導型のES細胞株に対してguide RNAライブラリを導入することで、ハプロイドES細胞の場合と同様に、両アレルに変異を有すES細胞を多数取得できると考えた。現在、guide RNAライブラリのES細胞株への導入を終え、その評価を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ハプロイドES細胞の利用が困難であったために、研究方法を再考する必要があったものの、新たな研究計画により、本来の目的に沿った研究を遂行できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cas9誘導型ES細胞株とguide RNAライブラリの併用による遺伝子破壊の効果を検証する。さらに、ES細胞を分化誘導したのちにCas9の活性を誘導すれば、当初の実験計画以上に、目的の表現型を示す細胞株を効率的に取得できると期待される。
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| Causes of Carryover |
実験上の困難を解決するために、Cas9誘導型ES細胞株を用いた実験系を開始し、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の実験系を検証するための細胞培養用試薬を購入する。
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