クロマチン立体構造に基づく遺伝子発現制御のゲノムワイドな解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26640113
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 曽根 正光 京都大学, iPS細胞研究所, 研究員 (90599771)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: クロマチン高次構造 / エンハンサートラップ / 転写制御 / 3C / 多能性幹細胞 / 分化

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子の発現制御にクロマチンの立体的な構造が非常に重要であることが近年知られるようになってきた。エンハンサーと呼ばれるゲノム中の配列は染色体上遠く離れた位置から、ループ構造を取ることで遺伝子のプロモーターに作用し、その発現を促進する。また、エンハンサーとプロモーターとの相互作用は、細胞の分化や、細胞外シグナルへの応答の際、大きく変化することが知られている。そうした相互作用を個々の遺伝子座について個別に解析する手法として、Choromosome Conformation Capture(3C)法と総称される手法がこれまでに開発されてきたが、ゲノムワイドに解析する手法はまだ確立されていない。
本研究は①エンハンサーと遺伝子のプロモーターの相互作用を網羅的に明らかにし、②それが細胞の分化に伴ってどの様に変化するのかを解析して、③エンハンサーによる転写活性化の新しい作用機序を解明することを目的としている。
そうした目的のため、本研究では第一に、ET3C法と名付けた全く新しい解析手法の開発を目指す。ET3C法ではまず、それ単独では活性を持たない最小プロモーター下に薬剤耐性遺伝子とGFPを搭載した、エンハンサートラップベクターと名付けたプラスミドベクターを細胞に導入し、ゲノム中にランダムに挿入させる。次に、薬剤により安定発現細胞を選択する。これらの細胞では、遺伝子領域に挿入された外来遺伝子カセットが内在性のエンハンサーと相互作用することで活性化されていると考えられる。さらに、そうした多様な挿入部位を持つ細胞を用い、挿入された外来遺伝子カセットに相互作用する領域を、従来の3C法と高速シーケンサーを用いて解析する。これにより遺伝子とその相互作用領域を網羅的に解析できると期待される。
当該年度はそのET3C法の確立を目指し、エンハンサートラップベクターの構築を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度はET3C法の確立を目標として研究に取り組んだ。
まず、エンハンサートラップベクターを構築することを目指したが、それを完成させることが出来なかったので、当初想定していた達成度からやや遅れていると言わざるを得ない。以下に、当該年度に行った工程について記す。
1. バックボーンとなるプラスミドベクターを取り寄せた（Solodushko, V. et al, 2014, Gene Therapy） 2.プロモーターを最小プロモーターに変換した。 3.そのプラスミドに薬剤耐性遺伝子とGFP遺伝子を挿入しようとしたが、挿入されたプラスミドを得ることが出来なかった。

Strategy for Future Research Activity

目的のプラスミドベクターを構築するために、これまで用いてきた制限酵素とライゲーションによる手法ではなく、In-Fusion cloning(Takara Clonetech)など異なる遺伝子工学的手法を用いてベクター作製を行う。さらに作製したベクターをES細胞に導入し、安定発現株を樹立し、ET3C-seqを行う。以上の工程を迅速に遂行する。

Causes of Carryover

当該年度には実施計画に比べて、研究に遅れが生じたために、使用予定であった高速シーケンサー用試薬を含む試薬類を購入しなかった。そのため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

分子生物学用一般試薬（核酸精製キット、HiSeq2000 シーケンスライブラリ作製用試薬およびフローセル、BioMark 用サンプル調製試薬およびチップ等を含む）、細胞培養用培地等の購入に使用する予定である。