2015 Fiscal Year Research-status Report
大腸菌染色体複製サイクル再構成による長大DNA増幅システムの開発
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26640116
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
末次 正幸 立教大学, 理学部, 准教授 (00363341)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の合成生物学の進展にともなって長鎖DNAを増幅するための技術に対する期待が高まっている。大腸菌細胞は自身の4.6 Mbにもなる巨大な環状ゲノムDNAを繰り返し安定に増幅する事が出来ている。本研究では、独自に構築した複製サイクル再構成系を用いて長鎖環状DNAを増幅させるための検討を行っている。この複製サイクル再構成は大腸菌ゲノム複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの「複製サイクル」の反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。長鎖環状DNAを調製するためλファージの組換えシステムを利用して大腸菌のゲノムを環状に抜きだす「ポップアウト法」を構築し、この方法により200kbまでの巨大な環状DNAをスーパーコイル構造を維持したまま精製する事に成功した。そしてこの200kbの巨大環状DNAを鋳型にして複製
サイクル再構成系の反応をおこなったところ、30度、3時間の反応で増幅産物の産生を確認する事ができた。増幅産物のなかにはスーパーコイル構造を持った200kb環状DNAの産物も含まれている事が確認された。今までに、試験管内でこれほどまでに巨大なDNAを環状のまま増幅できるといった反応系は報告されておらず、世界的にも初めての例である。複製サイクル再構成系は、200kbを超えるさら
に巨大な環状DNAを増幅するポテンシャルも持つと思われるが、今のところ環状DNAとして安定に調製できるDNAサイズが200 kbまでなので、今後さらに巨大な長鎖環状DNAを調製するための手法の検討が１つの課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、長大な環状DNAの安定化を高める工夫により、その増幅効率を高める条件を見出した。また、副次的な産物の産生を抑える条件も見出しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
長大な環状DNAの試験管内での安定化の手法と、副次的な増幅産物を抑えるための手法について、見通しが立ちつつある。よって、これらの条件をうまく組み合わせることで効率的な長鎖環状DNA増幅法としての確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
より安価な試薬を求め使用したため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
DNA解析実験における消耗試薬として使用する
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