2016 Fiscal Year Annual Research Report
Propagation of large circular DNA by reconstitution of a chromosome-replication cycle
| Project/Area Number |
26640116
|
|---|
| Research Institution | Rikkyo University |
|---|
Principal Investigator |
末次 正幸 立教大学, 理学部, 准教授 (00363341)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | DNA複製 / DNA増幅 / ゲノム / 大腸菌染色体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年の合成生物学の進展に伴って長鎖DNAを増幅するための技術に対する期待が高まってきている。大腸菌細胞は自身の5 Mbにもなる巨大な環状ゲノムDNAを安定的に増幅する事が出来ている。本研究では、独自に構築した「複製サイクル再構成系」を用いて長鎖環状DNAを増幅させるための検討を行った。この「複製サイクル再構成」は大腸菌染色体複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの「複製サイクル」の反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。
鋳型として用いる長鎖環状DNAとして、λファージの組換えシステムを利用して大腸菌細胞内で複製起点oriCを含む長鎖ゲノム領域を環状に抜きだす「ポップアウト法」により200kbの長鎖環状DNAを調製した。そしてこの200kb環状DNAを鋳型にして、複製サイクル再構成系の反応（30℃、３時間）により効率よく長鎖環状DNAを増幅するための条件を検討し、決定した。本研究で開発した増幅法では、元の鋳型と同じ環状構造の増幅産物DNAが得られる。そのため、そのまま形質転換の操作に用いることができるなど、これまでのDNA増幅法とは大きく異なる特徴を持つものである。
今後、バクテリアゲノムレベル（500 ~5,000 kb）の長鎖環状DNAを増幅可能か検討していき、「ゲノム丸ごと増幅技術」としての利用法を世の中に広めて行きたいと考えている。
|
