2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26640119
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
城口 克之 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (00454059)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ゲノムワイド / シークエンサ / デジタル定量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子バーコーディング法の標準化を目指し、低コストで高いダイナミックレンジを得るために、ランダムバーコードで核酸のデジタル定量が可能かを検討した。
ランダムバーコードを設計し、固定配列とランダムバーコードがデザインされたオリゴを複数購入した。これらの複数のオリゴを、既知の数、１つのチューブに入れ、ＰＣＲで増幅した。そして、増幅産物の配列を次世代シークエンサを用いて解読した。
まず、得られた配列を固定配列をもとに振り分けた。その後、各固定配列に分けられた配列の中に、いくつのバーコード配列が含まれるかを決定した。この時、バーコード配列の数が、増幅前の分子数となる。シークエンスエラーが起きると、そのエラーを含むバーコード配列をもつ分子がもとのチューブ内に存在したと解釈され、定量結果に大きな影響を与えてしまう。そこで、似ている配列は１つのバーコード配列としてまとめるために、ソフトウエアを使用してクラスター化処理を行った。クラスター数は、どれくらいのエラー・相違を許すか（どれくらい似ている配列を同じクラスターとするか）によって結果が大きく異なったが、最適な条件を見つけることができ、安定したクラスター数を求めることができた。このクラスター数は、ＰＣＲ前にチューブに入れた分子数とよく一致した。
この結果により、適切にバーコードをデザインし、適切な解析を行うことで、ランダムバーコードを用いて核酸数をデジタル定量できることが示された。低コストで高いダイナミックレンジを得ることができたという成果を発信することで、この技術の標準化が加速されると考えている。
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