2014 Fiscal Year Annual Research Report
マウスハプロイドES細胞を利用した合成救出システムの構築
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26640124
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
竹田 潤二 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50163407)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ゲノムワイド関連解析 / ハプロイドES細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ハプロイドES細胞をホストとして2種類の遺伝子を同時に欠損させ、新たな合成救出法の構築を目指して実験を行った。
まず、ハプロイドES細胞のROSA26遺伝子座へERT2-iCre-ERT2遺伝子を挿入（後に1つ目の遺伝子をタモキシフェン依存的に破壊するため）; 実際には遺伝子ターゲティングの効率がハプロイドES細胞は非常に低いので、ZFNを用いることによりターゲティングに成功した。
最近のCRISPR/gRNAは両アレル遺伝子を同時に破壊することが可能になったので、通常のディプロイドES細胞を用いる合成救出法もトライした。1つ目の遺伝子Oct4をコンディショナルアレルへ変換し、次にCRISPR/gRNAライブラリーを導入し、2つ目の遺伝子をランダムに破壊した。
そして、タモキシフェンによりCreを活性化し、1つ目の遺伝子を破壊し、分化せずに残存したクローンの解析を行った。コントロール細胞（gRNAライブラリーを導入したが、Cas9は発現していない細胞）は、分化せずに残存したクローンは認められなかった。しかし残存したクローンはOct4タンパクを発現していたので、現在さらに詳細な解析を進めているところである。
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