ＤＮＡメチル化紋様形成機構の構成的理解：合成エピゲノミクスへの挑戦

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26640131
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 伊藤 隆司 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90201326)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的はCRISR/Cas9の系を用いてエピジェネティック修飾酵素をゲノム上の特定の遺伝子座位にリクルートすることで、特異的なエピジェネティック修飾パターンを創出することで、出芽酵母をモデルに合成エピゲノミクスの可能性を探るところにある。
そのための要素技術として、ヌクレアーゼ活性を失ったCas9変異体dCas9を出芽酵母ゲノム中の任意の座位へターゲットする実験から着手した。当初、ゲノム中に150コピー存在するrRNA遺伝子座位をモデルにdCas9-GFPのターゲティングを、核小体への蛍光シグナルの集積で確認することを試みたが、複数のsgRNAについて、その有無による核小体の蛍光強度に関する明確な差異が認めることは出来なかった。
そこで、sgRNAの発現レベルとプロセシングに問題がある可能性を考慮して、それらを確認する実験系の構築を行った。更にsgRNAの性能を評価するために試験管内でCas9による標的プラスミドの切断を確認する実験系も導入した。これらを用いた評価から、それぞれのコンポーネントが十分量かつ正しい形状で発現しており、また標的切断において機能的であることを確認することが出来た。
一方、その後の検討によって、Cas9自体に核小体に集積する性質が認められ、また核小体への移行シグナルと判定される配列を有することが判明した。そこでrRNA遺伝子座を用いた評価は中止して、株によっては20コピーが縦列に存在するCUP1遺伝子座位を評価に用いることにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

dCas9の標的領域への集積を確認する実験に手間取り、当初は計画していなかった対照実験を行うことになったこと、およびその結果に基づきモデルとしても用いる遺伝子座を変更することになったために、当初の計画よりも振興が遅れた。

Strategy for Future Research Activity

CUP1遺伝子座位については有望なシグナルが得られ始めており、条件の最適化を進めることでdCas9の効率的なターゲティングの実現を目指す。その上でGFPとH3K9メチレースの双方を融合させたdCas9を利用して、エピジェネティック修飾パターンの形成を確認する実験に進む予定である。

Causes of Carryover

dCas9-GFPのrRNA遺伝子座へのターゲティングが確認できなかったため、当初の計画にはなかった各種の対照実験を行い、その結果に基づき対象遺伝子座を変更したために、計画の進行が予定より遅れて、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初計画にありながら26年度に実行できなかったコンストラクトの作成に必要な試薬を中心に使用する予定である。