2014 Fiscal Year Research-status Report
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26640133
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
渡部 暁 独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 上級研究員 (80300945)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 合成生物学 / 空間配置 / 複合酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初の計画に従いモデル代謝系の構築(遊離の酵素）に関する実験を以下のように実施した。
１．Acetyl-CoA以後の抗マラリア薬剤の人工合成経路の初期の3種類の酵素（ERG10, ERG13, tHMG1）すべてについて大腸菌無細胞系にて発現系を構築したところ、すべて可溶性に発現が確認され、Hisタグにて精製された酵素標品を得た。２．すべての基質および中間産物（Ac-CoA, AcAc-CoA, HS-CoA, HMG-CoA, NADPH, Mevalonate, Mevalonate 5-Phosphate)についてNMR測定を行い、酵素反応をモニターする際のリファレンス・スペクトルを取得した。３．各酵素のそれぞれについて試験管内で1H-1次元NMRおよび13C-1H HMQCの時間変化を観察し、リファレンスと比較することで、想定された酵素反応が確かに進むこと、および、その反応の時間変化をNMRで非破壊的・継続的に追えることが確認された。４．上記反応系で、特に、Ac-CoA ←→AcAC-CoAについては平衡が逆反応（Ac-CoA側）に大きく偏っており、順反応よりも副反応のモデルとして有用であることが判明した。５．正反応のモデルとして新たな酵素NphT7を追加で設計し、他の酵素同様に必要となる酵素の発現系の構築、酵素の調製を行なった。６．NphT7についてもその基質（malonyl-CoA）のリファレンス・スペクトルを取得するとともに、NMRにより酵素活性が確認された。
上記により4種類の酵素からなる正副反応をもつモデル代謝系の構築(遊離の酵素）に関する実験が終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画に大きな障害などはなく、予定通り進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
遊離の酵素について問題ないことが確認されたので、次のステップとして酵素を足場DNAに配置させるためのTALエフェクターとの融合タンパク質の発現を進めている。
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| Causes of Carryover |
必要となる試薬の一部で在庫切れ・輸入手配が必要であることが判明し、納期が遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬の納品時期が遅れたものの、実施すべき実験などについては当初計画に大きな変更はない。
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