イオン強度勾配を利用した新規スクリーニング法の構築

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26640138
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 三浦 健 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (20416001)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: スクリーニング法 / イオン強度 / マリアナ海溝底泥サンプル / 有用酵素生産菌

Outline of Annual Research Achievements

本研究計画の主題は、イオン強度の違いを利用した新規スクリーニング法を構築し、未知能力を有する新規微生物資源をスクリーニングすることにある。これまでに深海底泥サンプルを前処理条件の違いで、明らかに異なる微生物が観察された。その原因として、微生物と土壌粒子間に異なる電荷が生じ、両者が強弱な力で結合していたことが考えられた。そのため、イオン強度の違いによって両者を分離できるのではないかと推測した。そこで、本年度は、主にイオン強度勾配を利用する新規スクリーニング法を構築し、前処理液のpHと塩濃度を変化させることで、分離株の取得・保存を行うことを達成目標とした。まず、粒度の異なる粉末濾紙を用いて層を作製した後、その上に4種類のマリアナ海溝底泥コアサンプル（YK09-08）を重層した。前処理液として、酸性・中性・アルカリ性緩衝液、塩濃度6 Mまで徐々に上げて分取した。その分取液をMarine Broth 2216寒天培地に塗布し、25℃で14日間培養した。培養後、出現したコロニーの大きさ、色、形状を観察し、異なるコロニーを733株単離・保存した。異なるサンプルにおいて、異なるpHと塩濃度で単離した株において、特定の電離度で黄色の極小コロニーや白色の花形コロニーが出現するなど、形態が同じコロニーが、唯一同程度の電離度（伝導率）でそれぞれ観察できた。さらに、異なるpHと塩濃度において、同程度の電離度で分離したコロニーの形態が似ていた株の中には、同様の菌体外酵素を産生している株も観察できた。このことから、これらの株は同一のものである可能性が高いと考えられた。本年度の研究より、使用する緩衝液の種類や塩濃度の組み合わせの違い（電離度）によって取得できる微生物に違いが見られたことから、分離できる微生物が異なることが示唆された。現在、分離株の16S rRNA解析を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要でも述べたように、使用する緩衝液の種類や塩濃度の組み合わせの違い（電離度）によって、色や形状の異なる微生物が分離された。さらに、同程度の電離度で分離した株が産生する酵素が同じであること（平成27年度計画予定）を明らかにできたことは大きな進展であると考えられる（平成27年度に学会発表予定）。一方、同程度の電離度で分離した株の系統学的解析が遅れており、遺伝子レベルでの比較がしきれていない。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、同程度の電離度で分離した株の系統学的解析を行い、遺伝子レベルでの比較を行いたいと考えている。さらに、「平成27年度の研究計画・方法」に記載したイオン交換担体を用いて、分離株および標準菌株（大腸菌、枯草菌、酵母菌など）の結合力の違いを解析することで、本研究計画の目標達成に資する結果が得られるのではないかと考えている。