哺乳類ひげ毛根細胞の凍結保存・iPS細胞化・生殖細胞分化・体外受精

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26640139
• Research Institution: Fukuyama University
• Principal Investigator: 山口 泰典 福山大学, 生命工学部, 教授 (60191243)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 毛根 / ひげ / まゆげ / 細胞培養 / 添加物 / 培養基質 / 酵素処理

Outline of Annual Research Achievements

毛根に由来する細胞を効率よく培養する条件の把握に努めた。主な検討項目は、培養液の種類、添加する牛胎児血清（FBS）の濃度、FBS以外またはFBSに替わり得る添加物質とその濃度、培養基質及びコートする物質の効果、毛根部分の酵素処理条件である。実験材料としては、ヒトのまゆ毛及び毛髪、マウス・ラット・シリアンハムスター・ジャンガリアンハムスター・アカネズミ・ハリネズミのひげ及び体毛である。検討した培養液は、DMEM、DMEM/F-12、199、ASF104N、OptiPROSFM、Essential8、KeratinocyteSFM、DCDB153である。FBSは、0～30％の範囲で検討した。添加物は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、エタノールアミン、HyCloneSTEMFFを検討した。培養基質としては、細胞培養用ポリスチレンを基準として、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ポリLリシン、ポリLアルギニンの塗布効果を検討した。毛根を処理する酵素としては、トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼ及びコラゲナーゼを用いて、37℃で2分から1時間の範囲で検討した。その結果、培養液と添加物の組み合わせでは、DMEM+HyCloneSTEMFF、OpiPROSFM+HyCloneSTEMFF、OptiPROSFM+FBS20%およびEssential8において比較的良好に細胞が増殖した。シャーレへの塗布剤としては、Ⅰ型コラーゲン、ラミニンが好適であった。酵素処理については、ディスパーゼ、コラゲナーゼ及びアキュターゼ単独では効果が不十分であり、トリプシンでは効果が安定しなかった。また、毛根由来培養細胞は、ヒトまゆ毛から最も効率よく得られ、以下ヒト毛髪、アカネズミひげ、シリアンハムスターひげでも細胞が増殖したが、マウス、ラット、ジャンガリアンハムスターのひげと体毛では細胞が増殖しなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究以前の予備実験では、ヒトまゆ毛とアカネズミ及びシリアンハムスターのひげ毛根から細胞が培養できていたので、他の哺乳動物のひげや体毛についても、毛根から容易に細胞を培養し得ると予想していたが、本年度試みた条件下ではマウス、ラット、ジャンガリアンハムスターの毛根では殆ど細胞増殖を観察できなかった。従って、増殖した細胞については予定通りに研究を進捗させることが出来るが、哺乳類全般に汎用的な培養条件を把握できていないので、個別に最適条件を探索する必要が生じ、当初の研究計画からはやや遅れていると判断せざるを得ない。

Strategy for Future Research Activity

昨年度細胞が増殖しなかった動物についても、培養液、添加物と培養基質については、ほぼ検討し尽くしていると考えられるので、今後は酵素処理条件について、各酵素単独での最適化に加えて、酵素カクテルでの処理条件を探索する。また、本年度は、空気95％・炭酸ガス5％のインキュベータで全ての培養を実施したが、低酸素条件下での培養を試みる。また、増殖しやすい毛根と増殖し難い毛根の構造についてどのような差があるのかを検討して、対策を立てたい。増殖してきた細胞については、初期化を試みる。

Causes of Carryover

高額な牛胎児血清（FBS）の使用量の一部を他の添加物で代替え出来たので、予想使用額との間に差が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

化学的組成が明らかな培養液（CDM）をできるだけ使用し、高額でロット差があるFBSに起因する実験結果の不安定さを極力減らして、より再現性の高い実験系を構築する。採取した毛根部分の酵素処理条件の最適条件の探索と毛根由来細胞の初期化に注力する。