Breeding of fungi using fungal infectious virus "Mycovirus"

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26640141
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 白水 貴 三重大学, 生物資源学研究科, 助教 (10571789)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森山 裕充 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (20392673)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: マイコウイルス / 木材腐朽菌 / 多様性 / 機能 / ゲノム解読

Outline of Annual Research Achievements

真菌類に感染するウイルス，マイコウイルスの未知の多様性と機能を明らかにすることを目的とし，主に木材腐朽菌から検出されたマイコウイルス由来と考えられる二本鎖RNAの塩基配列の解読を行った．10菌株より精製した二本鎖RNAを鋳型として合成したcDNAを用い，次世代シーケンサーにて塩基配列を解読したところ，2菌株に由来する二本鎖RNAからマイコウイルス由来と考えられるRdRp領域および未知のタンパク質をコードする領域の配列が得られた．これらの領域を対象としたプライマーを設計し，PCR後，サンガー法にてRdRp領域および未知のタンパク質をコードする領域の内部配列を決定した．サンガー法にて決定されたこれらの内部配列は次世代シーケンサ―にて得られた配列と両末端を除きほぼ一致していた．
これらの領域の全配列を決定するため，RACE法による末端配列の解読を行った．それぞれの領域の両末端150bp～200bpを対象としたプライマーを設計し，RACE法およびDNAクローニングにより末端配列の解読を試みたが，目的の配列を得ることができなかった．この原因特定のため得られた配列のBLAST検索の結果を参照したところ，様々な生物や遺伝子由来と考えられる配列が得られていたことが分かった．このことから，おそらく，RACE用に設計したプライマー配列が適切ではなかったことが原因と考えられた．よって，新たなプライマーを設計し，反応条件を検討しなおした上で，再度RACE法による末端配列の解読を試みたものの，良好な結果は得られなかった．
そこで，再度，二本鎖RNAの配列解読法を検討しなおし，従来法よりもより高性能な網羅的RNAウイルス検出技術であるFLDS法（Fragmented and loop primer ligated dsRNA sequencing）による配列解読を試みている．