2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26650004
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
馬場 忠 筑波大学, 生命環境系, 教授 (40165056)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 低分子核酸 / ＤＮＡ・ｍＲＮＡハイブリッド / 遺伝子サイレンシング / ｍＲＮＡ分解 / 翻訳抑制 / 転写後調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
この研究は、細胞質内に低分子性の１本鎖DNAが存在し、それがmRNAとヘテロ２本鎖を形成することによって遺伝子サイレンシングに関与しているか否かを解明することを目的としている。
前年度の研究成果から、マウスのさまざまな組織から調製した全RNA標品に低分子DNAが含まれており、それがRNAとハイブリダイズしていることが強く示唆された。そこで、全RNA標品中に含まれる分子がDNAかどうかを明確にするために、まず、肝臓由来の全RNA標品を水酸化ナトリウム処理し、塩酸で中和後に分解されたRNAを除去した。次いで、脱リン酸化処理後にアイソトープでリン酸基を再修飾し、尿素ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。結果的に、ほぼ10塩基の単一スポットが得られ、これが目的のDNAと思われた。この低分子DNAは非常に微量であると考えられたので、その両末端に人為的に配列既知のアダプターを連結させて、PCR法で増幅させた後にベクターと連結させて塩基配列の決定を行った。この低分子DNAに相当するいくつかの配列、すなわちCGGCTGGAGCやACGGCGCGACなどが見いだされた。しかし、コントロール実験を行っても同様の配列を持つDNA様の分子が検出されたため、試薬などに混入した微量分子である可能性も否定できなかった。
全RNA標品へ外来性RNase Hを添加すると、時間経過とともにmRNAが限定分解を受ける。そこで、アクチンをモデルとして、低分子DNAが仲介する分解様式を調べた。アクチンcDNAから人工的にビオチン化したRNAを合成し、肝臓または精巣全RNA標品と混和させてRNase H処理を行った。得られた５個前後の分解産物を精製し、PCR法で増幅後に配列決定を行った。この実験によって、低分子DNAが関与する少なくとも６か所のアクチンmRNA結合部位を同定することができた。
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