2014 Fiscal Year Research-status Report
i-RNA切断酵素によるイノシン化RNAの分子制御機構の解析
| Project/Area Number |
26650006
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
倉岡 功 大阪大学, 基礎工学研究科, 准教授 (60335396)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | イノシン化RNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
RNAのイノシン化は、本来有する遺伝情報を変換する編集機構やウイルスRNAの排除機構に使われている。この機構はまだ解明されていない点が多いが、精神神経および癌などの疾患にも関与する生物学的に重要な機能であることが示唆されている。
応募者は、このRNA編集により生じたイノシンを有するRNA（i-RNA）を特異的に切断するタンパク質i-RNA切断酵素（ヒトエンドヌクレアーゼV）を発見した。この酵素の細胞における機能を明らかにし、i-RNA切断酵素によるイノシン化RNAの分子制御機構を解明することがこの研究の目的である。
この酵素の機能を調べるために、様々な構造をもつRNA基質を化学合成により調整し、その結合活性および切断活性を解析する。また、細胞内での機能を解明するために、結合タンパク質解析および標的遺伝子破壊技術によりi-RNA切断酵素欠損細胞を樹立することによって、i-RNA切断酵素によるイノシン化RNAの分子制御機構を解明する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
このRNA編集により生じたイノシンを有するRNA（i-RNA）を特異的に切断するタンパク質i-RNA切断酵素（ヒトエンドヌクレアーゼV）の機能を調べるために、様々な構造をもつRNA基質を化学合成により調整し、その結合活性および切断活性を解析した。その結果、切断ためには幾つか条件が必須であることが明らかになった。
また、FLAGタグおよびHisタグを付加したi-RNA切断酵素安定発現ヒト胎児腎臓由来HEK２９３細胞を樹立、大量培養し、細胞抽出液から、アフィニティー精製によってi-RNA切断酵素を精製した。しかし、この酵素に特異的に結合するタンパク質は検出できなかった。一方、組換えタンパク質を精製し、これを用いて抗体を作製することができた。これらの解析結果は、概ね良好と言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
i-RNA切断酵素の細胞内での機能を解析するために、標的遺伝子破壊技術を用いてそれらの欠損細胞を樹立し、その細胞の生育にどのような影響が表れるか？もしくはRNA編集にどのような影響が示されるか、また細胞内にどれくらいi-RNAが蓄積するのかを観察する。
さらに、RNAウイルスのミミックとしてdsRNAを細胞に導入することで、外来からのRNAの量をRT-PCRを用いて観察する。
|
Research Products
(10 results)
-
[Journal Article] The SLX4 complex is a SUMO E3 ligase that impacts on replication stress outcome and genome stability.2015
Author(s)
Guervilly JH, Takedachi A, Naim V, Scaglione S, Chawhan C, Lovera Y, Despras E, Kuraoka I, Kannouche P, Rosselli F, Gaillard PH.
-
Journal Title
Mol Cell.
Volume: 57
Pages: 123-137
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Guanine- 5-carboxylcytosine base pairs mimic mismatches during DNA replication.2014
Author(s)
Shibutani T, Ito S, Toda M, Kanao R, Collins LB, Shibata M, Urabe M, Koseki H, Masuda Y, Swenberg JA, Masutani C, Hanaoka F, Iwai S, Kuraoka I.
-
Journal Title
Sci Rep.
Volume: 4
Pages: 5220
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
-
-
-
-
-
