2015 Fiscal Year Research-status Report
精製超分子複合体を用いた葉緑体蛋白質膜透過反応の完全再構成と構造ダイナミズム
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26650017
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中井 正人 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (90222158)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛋白質膜透過 / 膜蛋白質複合体 / 再構成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、植物葉緑体内包膜特有のトランスロコンに関して、中心因子Tic20にアフィニティタグを付加した形質転換植物を用い、１メガダルトンの超分子膜蛋白質複合体として精製する事に成功した。さらに、この精製超分子複合体をリポソームに組み込む事で、前駆体と相互作用するチャネル活性の測定にも成功している。さらに、本研究では、新奇に見出した輸送モーター複合体をも含めた超複合体を精製し、再構成する事で、真核生物型トランスロコンではほとんど成功例がない、トランスロコンと輸送モーター複合体による蛋白質膜透過過程の完全再構成系を構築し、膜透過反応完了まで含めた各素過程の詳細な解析が可能となると研究を計画した。
現在までのところ、クオリテイに関しては、十分な精製度を保ったまま、トランスロコンとモーターの２者複合体の精製には成功している。ただし、それを再構成に用いるには、量的な問題をクリアーする必要がある。見積もりでは、精製量を現在の１０倍以上には高める必要がある。出発材料を単純に増やすだけでは、植物体の栽培や葉緑体の調製、そこからの精製にかかる実験材料費、消耗品費用が、非常に多量に必要となり現実的ではない。したがって、現在の精製方法を抜本的に見直し、精製効率を１０倍以上に上げる必要があり、その精製条件の検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
精製には、非常に特異性の高いアフィニティタグを付加した形質転換植物を用いている。このタグの特異性は高いが、そのタグ部分の複合体からの露出度が低いせいか、精製効率が悪く１０％以下であり、ここを１００％近くするブレークスルーが必要であり、タグ部分の露出度が増すような精製条件の検討を進める必要がある。一方で、タグを改変した形質転換植物を準備する事も必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
タグ部分の露出度が増すような条件として、使用するデタージェントの種類を変える試みを進めている。また、使用する塩の種類や濃度も最適下が必要である。また、タグを認識するレジンも、複数種類試す必要がある。さらには、自前で、タグを効率よく認識するレジン自身を調製する事も考えたい。
タグ配列そのものの変更も視野に入れて研究を進めたい。植物の場合、形質転換植物の確立には時間がかかるが、大量に複合体を調製するには、多少時間がかかってもう有効なタグを持つ複合体を発現する植物を利用したほうが、最終的には良いのでないかと考えており、この点についても、新奇なタグの種類などを検討中である。
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| Causes of Carryover |
精製には、非常に特異性の高いアフィニティタグを付加した形質転換植物を用いている。このタグの特異性は高いが、そのタグ部分の複合体からの露出度が低いせいか、精製効率が悪く１０％以下であり、ここを１００％近くするブレークスルーが必要であり、タグ部分の露出度が増すような精製条件の検討を進める必要がある。一方で、タグを改変した形質転換植物を準備する事も必要である。
精製条件の検討は、スモールスケールで行っているため、消耗品等の物品費は、初年度購入分以外は発生しなかった。しかし、最終目標であるミリグラムオーダーの精製には、消耗品の購入が必要となり、次年度に繰り越した。また、精製を行う特任研究員の雇用費も２ヶ月分次年度に繰越して確保した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
再構成条件を確立させるためには、さらなる条件検討が必要であり、またスケールアップしていく必要がある。次年度に繰越した研究費は、特任研究員の雇用費と、アフィニティ樹脂の購入などの物品費として使用する予定である。
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