2014 Fiscal Year Research-status Report
独自開発したオートファゴソーム単離法を用いたオートファゴソーム膜の脂質成分解析
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26650019
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
長谷川 純矢 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (00533788)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | オートファジー / 脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内大規模分解システムであるオートファジーは、飢餓やストレスに対する機構だけでなく、近年の研究により多くの疾患発症に関わることが知られている。オートファジーを駆動するオルガネラであるオートファゴソームは、そのタンパク質成分に関しては多くの知見があるものの、主な膜成分である脂質においては全く理解されていない。そこで本研究計画では、我々が独自に開発したオートファゴソーム単離法を用いて、網羅的な脂質成分解析を行うことを目的としている。
当該年度においては、まず条件検討を主に実施した。我々の単離法は遺伝子導入試薬をまぶしたラテックスビーズを細胞に取り込ませ、そのビーズを回収する極めて単純な方法である。これまではMEF細胞を用いていたが、取り込み効率が良いHeLa細胞にシフトすることにした。MEF細胞ではすでにオートファジー不全のノックアウト細胞があるが、新しいゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを用いてHeLa細胞でもノックアウトが可能になった。そのシステムで幾つかのオートファジー遺伝子が欠損したHeLa細胞を作製することに成功した。さらに、ビーズの量や精製方法も検討した結果、現在ではオートファゴソームを最大限取得できる条件を見出している。
最終年度には、これらの条件により実際にオートファゴソームを大量に精製し、リピドミクスを行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に書かれている条件検討は完了しており、後は実際にリピドミクスを行うだけである。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラテックスビーズの取り込み効率の良いHeLa細胞を用いて、1サンプルあたり10cmディッシュ5枚の細胞からサンプルを回収する。コントロールとして、オートファジー不全の細胞などを用いる。スクロース密度勾配法により、ビーズを精製し、脂質抽出を実施する。その後、共同研究先である東京大学大学院薬学系研究科の新井洋由研究室並びに理化学研究所の有田誠研究室に送付し、質量分析器を駆使してリピドミクスを実施する。
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Research Products
(3 results)
