2015 Fiscal Year Annual Research Report
GFPラベルを用いた位置同定単粒子像解析法（GPS法）の開発
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26650021
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
加藤 貴之 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (20423155)
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2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 低温電子顕微鏡 / 単粒子解析 / GFPラベル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低温電子顕微鏡による構造解析技術は近年飛躍的に向上した。しかし、標的としてる超分子複合体が柔軟な場合、その分解能を上げるのは困難である。超分子複合体を構成する個々の分子の構造がX線結晶構造解析などで明らかになっているにも関わらず、電子顕微鏡による構造解析の分解能が十分でないため、満足なフィッティングができない例も少なくない。そこで、フィッティングしたい分子に、GFPを改変したcpGFPを導入し、その余分な密度を同定することで、標的分子の位置と方向を決定するためのラベルとして用いるための基盤技術の開発を試みた。
本研究では細菌のべん毛モータの回転子を構成するFliMを標的分子として用い、cpGFPラベル化実験を行った。FliMは332残基からなるタンパク質で、44-226残基までの構造がX線結晶構造解析などで明らかにされている。
cpGFPを標的分子の途中に導入しても両者の構造が阻害されたないようにするため、立体構造を基に、前年度選定した34、134、219残基に加え、合計の12か所を選定した。
それぞれの残基の直後にcpGFPを導入し、タンパク質発現をウェスタンブロッティングにより確認したところ、すべての候補においてその分子の発現を確認することができた。次にラベル化FliM導入によるべん毛モータの機能回復を、位相差顕微鏡による遊泳の確認をするによって評価したところ、34残基及び233残基の直後にcpGFPを導入したラベル化FliMでのみ遊泳が確認され、ラベル化FliMはべん毛の機能を保持していることが確認できた。その2つの候補のべん毛モータを精製し、電子顕微鏡で観察したところ、ラベル化FliMがべん毛モータから解離していることが確認され、構造解析することができなかった。cpGFPの導入によって、細胞中での機能及び構造は保持されてたが、複合体の安定性が低下していることが示唆された。
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[Presentation] 単粒子解析のための分子同定用GFPラベル2015
Author(s)
Kato, T., Terahara, N., Miyata, T., Namba, K.
Organizer
第53回日本生物物理学会年会, 金沢大学（石川県）
Place of Presentation
金沢大学（石川県金沢市）
Year and Date
2015-09-14 – 2015-09-14
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