嫌気条件下で結晶化の成功率を高める手法の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26650026
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 千田 美紀 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任助教 (10707467)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: タンパク質の結晶化 / 嫌気条件下での結晶化 / 嫌気チャンバー / 結晶化の再現性向上

Outline of Annual Research Achievements

X線結晶構造解析でタンパク質の結晶構造を決定するためには、結晶を得ることが必須であるが、結晶が得られない問題がよく生じるため、結晶化スクリーニングの成功率や結晶化の再現性を高める方法の開発が待ち望まれている。このような問題は、スクリーニングの数を増やすだけでは解決できないことも多く、タンパク質側に問題があることも少なくない。我々は、時間の経過とともに増えていく酸化膜に注目し、タンパク質の酸化やその結果生じるタンパク質の変性も結晶化を妨げる要因となり得ると考えていた。
本研究の目的は、はじめに嫌気条件下での結晶化の有効性を証明し、その後、嫌気条件下でのタンパク質結晶化技術を誰でも簡単に試すことができる手法へと進化させ、多くのタンパク質の結晶化へ適用できるようにすることである。それにより、酸化されやすく通常の好気条件下での結晶化スクリーニングでは結晶化条件を見つけることができなかったタンパク質や、結晶化の再現性が悪く、安定して結晶を得ることが難しかったタンパク質の結晶化を成功させることが可能になる。
本年度は、結晶化条件が未知のタンパク質のサンプルについて嫌気条件下での結晶化を試みた。このサンプルは、ピロリ菌のCagAと相互作用することが知られているタンパク質であり、好気条件下では非常に酸化されやすく大量の酸化膜を生じてしまい結晶化が困難であることが問題になっていた。そのため、嫌気条件下でタンパク質の酸化を抑制することにより結晶化を成功させることを試みた。その結果、嫌気条件下では0.5 mm程度の大きさの棒状結晶を再現性良く得ることに成功し、2.0 A分解能の回折データを得るに至った。このタンパク質については既に結晶構造決定にも成功しているが、嫌気条件下での結晶化なしでは、結晶構造解析は困難であった。嫌気条件下での結晶化は、様々なタンパク質の結晶化に適用できると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Use of multiple cryoprotectants to improve diffraction quality from protein crystals. (2016)
  • Author(s): Senda, M., Hayashi, T., Hatakeyama, M., Takeuchi, K., Sasaki, A. & Senda, T.
  • Journal Title: Crystal Growth & Design Volume: 16 Pages: 1565, 1571
  • DOI: 10.1021/acs.cgd.5b01692
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The Lipid Kinase PI5P4Kβ Is an Intracellular GTP Sensor for Metabolism and Tumorigenesis. (2016)
  • Author(s): Sumita, K., Lo, Y., Takeuchi, K., Senda, M., Kofuji, S., Ikeda, Y., Terakawa, J., Sasaki, M., Yoshino, H., Majd, N., Zheng, Y., Kahoud, E. R., Yokota, T., Emerling, B. M., Asara, J. M., Ishida, T., Locasale, J. W., Daikoku, T., Anastasiou, D., Senda & T., Sasaki, A. T.
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 61 Pages: 1, 12
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.12.011
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of acetophenone reductase from Geotrichum candidium NBRC 4597. (2015)
  • Author(s): Sugiyama, Y., Senda, M., Matsuda, T. & Senda, T.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F Volume: 71 Pages: 320, 323
  • DOI: 10.1107/S2053230X15002265.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 嫌気条件下で結晶化の成功率を高める手法 (2015)
  • Author(s): 千田美紀、千田俊哉
  • Organizer: BMB2015
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-03 – 2015-12-03
• [Presentation] A comprehensive strategy to obtain high quality crystals. (2015)
  • Author(s): Miki Senda, Toshiya Senda
  • Organizer: American Crystallographic Association (ACA) 2015
  • Place of Presentation: フィラデルフィア（米国）
  • Year and Date: 2015-07-29 – 2015-07-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] タンパク質結晶の質を効率良く改善するための結晶工学的処理の手法 (2015)
  • Author(s): 千田美紀, 千田俊哉
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-26 – 2015-06-26
  • Invited