ショウジョウバエを用いたヘパラン硫酸プロテオグリカン結合蛋白質の網羅的解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26650041
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 三枝 智香 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 研究員 (00280800)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 信明 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, プロジェクトリーダー (90202308)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ヘパラン硫酸プロテオグリカン / ショウジョウバエ / 神経筋接合部 / 質量分析 / タンパク質間相互作用

Outline of Annual Research Achievements

前年度、野生型ショウジョウバエ3齢幼虫体壁筋（神経筋接合部を含む）を用いて質量分析によりヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）結合タンパク質候補を同定した。今年度はヘパラン硫酸合成酵素欠失変異体(botv)を用いて同様の実験を行った。botv変異体の結果をネガティブコントロールとして野生型の結果と比較し、より確実なHSPG結合タンパク質候補を絞り込んだ。これらの候補タンパク質から構造や発現様式などに関する既知情報を元に、神経発生において重要な機能をもつことが示唆されるタンパク質を検討し、優先的に詳細な解析を進めるタンパク質を決定した。
これらのHSPG結合タンパク質について、生体内での発現細胞を同定するため特異抗体を入手し免疫染色を行った。特異抗体が市販されていないタンパク質については、大腸菌による組み換えタンパク質を作製し、これを抗原としてウサギポリクローナル抗体作製を行った。また、S2細胞にHSPG結合タンパク質をHSPGとともに共発現させ、共沈実験を行った。その結果、HSPG結合タンパク質はコアタンパク質特異的にHSPGと相互作用をすることが明らかとなった。さらにゲノム編集のシステムを用いてHSPG結合タンパク質欠失変異体の作製を開始した。
以上の結果より、今年度優先的に解析を進めたタンパク質はHSPGと結合し、それらとHSPGとの相互作用が生体内で重要な役割を持つことが示唆された。
以上の研究結果を平成27年度日本神経科学会大会で報告した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度同定したHSPG結合タンパク質候補群の中から、今年度はより確実なHSPG結合タンパク質候補を絞り込み、詳細な解析を開始した。生化学的解析や遺伝学的解析を行ったところ、それぞれHSPGと特異的に相互作用することを示唆する結果を得た。またこれらのタンパク質はこれまでHSPGの解析が行われていない細胞においても発現が認められることから、引き続き解析を進めることで、HSPGと結合タンパク質の相互作用の新たな機能を明らかにできると考えている。
以上の結果より、新規のHSPG結合タンパク質の同定および解析は順調に進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今年度、解析を進めたHSPG結合タンパク質について、引き続きショウジョウバエを用いた遺伝学実験やショウジョウバエ由来細胞株（S2細胞）を用いた生化学実験などを行い、HSPGとの相互作用が生体内でどのような機能を持つかを明らかにする。
またこれらのHSPG結合タンパク質の発現・局在がHS修飾酵素変異体において、野生型とどのように異なっているかを解析し、HSPGと結合タンパク質の相互作用におけるHS糖鎖構造の機能的重要性を明らかにする。

Causes of Carryover

HSPG結合タンパク質欠失変異体作製および特異抗体作製について現在進行中であるため、予定していた費用を次年度に繰り越して使用する。

Expenditure Plan for Carryover Budget

HSPG結合タンパク質の遺伝学実験および生化学実験に必要な物品の購入に主に使用する予定である。