機能未知天然変性タンパク質の細胞医療への応用

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26650048
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 廣明 秀一 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (10336589)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 医薬品添加剤 / 国内優先権による出願 / 国際特許出願 / バイオ医薬品安定化剤 / 凍結保護剤 / 再生・細胞医療

Outline of Annual Research Achievements

本研究はヒトゲノム由来の天然変性タンパク質（IDP）から医薬品ないし医療用細胞の添加剤・保護安定剤を開発することを目的とした研究である。本研究は、ヒト由来の５種類のIDPが、乳酸脱水素酵素LDHの酵素活性に対して、高い凍結保護活性を示したという申請者独自の研究結果に着想を得て開始された。

ヒト由来IDPを利用した凍結保護剤の国内特許について、本研究採択までに出願済みであった。研究開始後、別の酵素であるグルタチオンS転移酵素、酵素ではないタンパク質のモデルである緑色蛍光タンパク質の、それぞれに対して、標品であるウシ血清アルブミンと同等ないしそれを上回る凍結保護活性を確認した。更に、既に得られている5種類のIDPの部分ペプチドを計9種用意し、それらすべてのLDHに対する凍結保護活性を測定した。その結果、同等以上の凍結保護活性を示す20アミノ酸のペプチドFK20を同定した。これらの結果を実施例として追加し、2015年1月に、国内優先権に基づく新たな特許を出願すると同時にPCTによる国際出願を完了した。更に、IDPによる凍結保護のメカニズムが、一般的な高分子クラウディング効果における、分子盾効果によるものであるとの仮説を立てた。高温で動作する酵素、耐熱性DNAポリメラーゼの経時的活性低下に対してもヒト由来IDPの一つが保護効果を持つことから、前記仮説の一部が検証できた。

一方、細胞の凍結保存液への応用研究を行った。COS7、HeLa、NIH3T3などの確立された培養細胞株では、DMSOが2.5%以上の条件で、モデル天然変性タンパク質であるセリシン添加の効果は見られなかった。しかし、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の系では、DMSOのみでは十分な凍結保存ができず、FK20の添加（終濃度0.1%）が有効であった。この凍結保護効果はセリシンよりも顕著であった。

Research Products

• [Journal Article] Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1–42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (2016)
  • Author(s): Shigemitsu, Y., Iwaya, N., Goda, N., Matsuzaki, M., Abe., Y., Narita, A., Tenno, T. Hoshi, M., and Hiroaki, H.
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: 498 Pages: 59-67
  • DOI: 10.1016/j.ab.2015.12.021
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Method for Systematic Assessment of Intrinsically Disordered Protein Regions by NMR (2015)
  • Author(s): Goda, N., Shimizu, K., Kuwahara, Y., Tenno, T., Noguchi,T., Ikegami, T., Ota, M., and Hiroaki, H
  • Journal Title: Intternational Journal of Molecular Sciences Volume: 16 Pages: 15743-15760
  • DOI: 10.3390/ijms160715743
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] An optimized Npro-based method for the expression and purification of intrinsically disordered proteins for an NMR study. (2015)
  • Author(s): Goda, N., Matsuo, N., Tenno, T., Ishino, S., Ishino, Y., Fukuchi, S., Ota, M., and Hiroaki, H
  • Journal Title: Intrinsically Disordere Proteins Volume: 3 Pages: 1-6
  • DOI: 10.1080/21690707.2015.1011004
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] 用語解説：天然変性タンパク質 (2015)
  • Author(s): 廣明秀一
  • Journal Title: 日本再生医療学会雑誌-再生医療 Volume: 13 Pages: 52-53
• [Presentation] HFIP中におけるβアミロイド(1-42)ペプチドの二量体形成 (2016)
  • Author(s): 重光佳基、岩谷奈央子、天野剛志、合田名都子、松崎瑞季、成田哲博、星美奈子、廣明秀一
  • Organizer: 201５年度生物物物理学会中部地区講演会
  • Place of Presentation: 愛知県岡崎市
  • Year and Date: 2016-02-29 – 2016-02-29
• [Presentation] 化学シフト温度依存性に着目した天然変性タンパク質領域の同定法 (2016)
  • Author(s): 岡崎寛貴、松尾直紀、天野剛志、廣明秀一
  • Organizer: 201５年度生物物物理学会中部地区講演会
  • Place of Presentation: 愛知県岡崎市
  • Year and Date: 2016-02-29 – 2016-02-29
• [Presentation] 医療応用を志向したタンパク質・細胞の凍結保護剤 (2016)
  • Author(s): 廣明秀一
  • Organizer: 第２回メディカルメッセ（中部地区 医療・バイオ系シーズ発表会）
  • Place of Presentation: 愛知県名古屋市
  • Year and Date: 2016-02-03 – 2016-02-04
• [Presentation] "Use of principal component analysis of 1H-15N NMR spectra of amyloid- (1–42) peptide for characterization of fibril formation inhibitors. " (2015)
  • Author(s): H. Hiroaki*, N. Iwaya, M. Matsuzaki, Y. Shigemitsu, N. Goda, Y. Abe, M. Hoshi, A. Narita
  • Organizer: PACIFICHEM 2015
  • Place of Presentation: Honolulu, Hawaii, USA
  • Year and Date: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cryoprotective Activity in Human Genome-derived Intrinsically Disordered Proteins and Their Pharmaceutical Applications (2015)
  • Author(s): H. Hiroaki*
  • Organizer: 2015 The 5th NU-TECH ROUND TABLE
  • Place of Presentation: Raleigh, NC, USA
  • Year and Date: 2015-11-04 – 2015-11-04
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] Special Periodical Reports; Nuclear Magnetic Resonance Volume 45 (2016)
  • Author(s): Hiroaki, H
  • Total Pages: 22
  • Publisher: Royal Society of Chemistry
• [Remarks] 天然変性タンパク質のNMR解析と医療応用
  • URL: http://presat-vector.org/hiroaki-lab/?p=116
• [Remarks] 【特許出願情報】「タンパク質凍結保護剤」に関する特許出願
  • URL: http://presat-vector.org/hiroaki-lab/?p=1048
• [Remarks] 新規のバイオ医薬品の保存用安定化剤
  • URL: http://www.engg.nagoya-u.ac.jp/techno/techno2015/booth/no23.php