二重特異性を有する分子認識機能性分子を利用した新規結晶化法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26650051
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 柴田 直樹 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (30295753)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 結晶化 / 分子ディスプレイ / X線構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究はラン藻Nostoc punctiforme由来Np275-Np276をベースにして設計した人工Penta-peptide repeat protein (PRP) の表面にランダム配列を導入することで、複数の面で特定のタンパク質分子と特異的相互作用することを可能する。それを利用して、構造を知りたい標的分子と任意の足場タンパク質分子とを連結することで結晶化用巨大足場タンパク質の創製を目指すものである。本年度は人工PRPと相互作用する足場タンパク質との複合体の結晶化を目指した。足場用の標的分子として、H26年度に用いたホルミルグリシンアミド合成酵素は安定性に問題があり、長期保存に向かないことが分かった。そのためH27年度は新しい標的分子として大腸菌由来の4-alpha-glucanotransferase(MalQ)を採用した。MalQは安定で、長期保存が可能であることを確認した。これまでに人工PRPとMalQとの複合体を調製し、その結晶化に取り組んで来たが、現状では結晶は得られていない。
一方、従来利用してきたリボソームディスプレイ法ではRNAをテンプレートとして取り扱うため、リボヌクレアーゼに対する感受性が高い。そのためヌクレアーゼ混入に極力注意を払う必要がある。一方、安定性の高いDNAを取り扱うCISディスプレイ法では、ヌクレアーゼ混入に大して過敏に対処する必要がない。CISディスプレイ法を利用することで、取り扱いが従来よりも容易になった。H27年度中にCISディスプレイ法による系を確立することが出来たので、従来よりも迅速に実験を進めることが可能になった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

人工PRPと相互作用するscaffoldタンパク質との複合体の調製を行ったが、現状では研究計画で予定していた結晶化に至っていない。

Strategy for Future Research Activity

従来利用してきたリボソームディスプレイ法よりも取り扱いが容易なCISディスプレイ法による系を確立することが出来たので、今後はCISディスプレイ法を利用することで従来よりも効率的かつ迅速に実験を行うことが可能になる。それによって、研究計画書に記載した複合体の構造解析に至ることを期待している。

Causes of Carryover

主に２つの理由があり、一つは当初の研究計画よりもやや遅れたことにより、遅れた分の消耗品費を使用しなかったこと、もう一つはCISディスプレイ法の採用により、従来よりもグレードの低い消耗品の利用が可能になったことやヌクレアーゼ混入防止に必要な物品を購入しなくても良くなったことによる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の研究計画よりもやや遅れた分に相当する費用として利用するほか、可能であれば実験時間短縮に寄与出来る物品の購入に充てる。