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2014 Fiscal Year Research-status Report

小胞体回避モチーフ作用因子の同定への挑戦

Research Project

Project/Area Number 26650063
Research InstitutionUniversity of Hyogo

Principal Investigator

阪口 雅郎  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (30205736)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2016-03-31
Keywords細胞オルガネラ / シグナル配列 / トランスロコン / 膜タンパク質
Outline of Annual Research Achievements

真核細胞の分泌経路のオルガネラ膜の膜タンパク質は、小胞体で膜に組み込まれ、小胞輸送で最終存在部位へ運ばれる。小胞体への標的化は、疎水性の高いアミノ酸配列からなるシグナル配列によって担われている。一方、ミトコンドリアやペルオキシソームの膜タンパク質は高い疎水特性を有するにもかかわらず、この小胞体標的化機構を回避して、合成完了後にそれぞれへ移行する。ABC輸送体ファミリーのペルオキシソーム型アイソフォームであるABCD3のN-末端に、小胞体標的化を抑制するモチーフ(N12と略)が存在することを見出し、作用特性を研究してきた。本研究では、N12に作用するタンパク質因子の解明を通して小胞体回避機構の解明を目指した。N12との化学架橋反応を活用した生化学手法や、N12に近接するタンパク質をビオチン化によって追跡する細胞生物学的手法、酵母ツーハイブリッド法など、原理の異なる複数の手法を試みた。BioIDを活用したビオチン化による検出、酵母ツーハイブリッド法による結合因子のスクリーニングでは有意な因子の検出同定には至らなかった。無細胞系で作成したN12をアミノ末端に含む新生ポリペプチド鎖リボソーム中間体と化学架橋反応を利用して、2種のタンパク質性因子の検出に成功し、この複合体をショ糖密度勾配法で精製することによって架橋効率が格段に向上することを明らかにした。この架橋反応系を指標として、ウサギ網状赤血球溶血液より、硫安分画、疎水性クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフ、ショ糖密度勾配遠心分画によってN12作動性因子の精製を実行した。その結果、活性と相関良く分画される数本のポリペプチド鎖の検出にまで至っている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、化学架橋反応を活用し相互作用因子の検出に成功し、さらに架橋プローブであるリボソーム新生鎖複合体をショ糖勾配遠心で部分精製することによって架橋反応を効率化できた。さらに、生化学的分画後の因子の検出が可能になった。この成果は、親和性クロマトグラフ法、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法、BioIDによるビオチンラベル法、などの多様な方法論でも達成できなかった後、可能となった。この検出系を使って、様々なクロマトグラフィー画分での因子の検出が、再現性良く定量的に可能となった点は評価に値すると考える。分画を進めて、結合因子と考えられる候補タンパク質の絞込みが可能な段階に到達している。また、N12作用に決定的に重要な5番目のSer残基に重要性を全長のABCD3分子で確認できていなかったが、細胞内分解による複雑さを克服して、全長においてSer5Ala変異体は小胞体に標的化することを実証した点も特筆すべき進展である。

Strategy for Future Research Activity

今後、生化学分画によって絞られたタンパク質を質量分析法によって同定し、候補タンパク質の組み換え型を発現し、それらの精製標品を使った結合活性の確認、ドミナントネガティブ作用の検討、ノックダウンの効果の検討、ノックアウト動物の作出と表現形の検討、過剰発現の効果の検討、培養細胞での局在の検討などを通して、小胞体標的化抑制因子としての作用を明らかにする。さらに、抗体作成を行い、その阻害作用、内在性タンパク質の細胞内局在、臓器による発現の違いを調べる方向性で鋭意進行の予定である。

Causes of Carryover

今年度、化学架橋によるアッセイでN12モチーフ作用因子の精製のメドがたったが、その同定のための質量分析が次年度に持ち越しとなったため、その費用を次年度使用とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額は、タンパク質の質量分析のための、タンパク質の精製、電気泳動機器の整備、質量分析の委託費用として使用する予定である。

  • Research Products

    (10 results)

All 2014

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (9 results)

  • [Journal Article] A few positively charged residues slow movement of a polypeptide chainacross the endoplasmic reticulum membrane2014

    • Author(s)
      Yamagishi, M., Onishi, Y., Yoshimura, S., Fujita, H., Imai, K., Kida, Y.,and Sakaguchi, M.
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 53 Pages: 5375-5383

    • DOI

      10.1021/bi500649y441

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] A clathrin accessory protein NECAP1 directs internalized ABCC2 to the apical plasma membrane in HepG2 cells2014

    • Author(s)
      衣斐義一, 畠 靖子, 阪口雅郎
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンにおける疎水性配列の動的な膜透過停止について2014

    • Author(s)
      木田祐一郎, 石原裕大, 藤田英伸, 阪口雅郎
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] リボソームトンネル内の新生鎖がトランスロコン内の疎水性配列の動きに影響する2014

    • Author(s)
      高橋千恵, 大西由希子, 木田祐一郎, 柳谷耕太, 河野憲二, 阪口雅郎
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンにおける新生鎖の動き駆動要因2014

    • Author(s)
      高原教代, 藤田英伸, 宇山侑希, 木田祐一郎, 阪口雅郎
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 親水性セグメントによるトランスロコンの占有と後続TMの膜組み込み阻止2014

    • Author(s)
      吉村正太郎, 大西由希子, 木田祐一郎, 阪口雅郎
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンによる疎水性配列の識別及び膜内配置機構の解析2014

    • Author(s)
      木田祐一郎, 石原裕大, 藤田英伸, 阪口雅郎
    • Organizer
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜(横浜市中区)
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [Presentation] リボソームは伸長直後のポリペプチド鎖の配列をトンネル内で感知しトランス ロコンの機能を制御する2014

    • Author(s)
      高橋千恵, 大西由希子, 木田祐一郎, 柳谷耕太, 河野憲二, 阪口雅郎
    • Organizer
      第66回日本細胞生物学会大会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂(奈良市春日野町)
    • Year and Date
      2014-06-11 – 2014-06-13
  • [Presentation] 細胞内に取り込まれたABCC2のapical側細胞膜への再局在化とNECAP1の関連2014

    • Author(s)
      衣斐義一, 畠靖子, 青木圭, 阪口雅郎
    • Organizer
      第66回日本細胞生物学会大会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂(奈良市春日野町)
    • Year and Date
      2014-06-11 – 2014-06-13
  • [Presentation] ペルオキシソーム膜タンパク質の小胞体標的化を抑制する因子の探索2014

    • Author(s)
      阪上春花, 木田祐一郎, 阪口雅郎
    • Organizer
      第66回日本細胞生物学会大会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂(奈良市春日野町)
    • Year and Date
      2014-06-11 – 2014-06-13

URL: 

Published: 2016-05-27  

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