2015 Fiscal Year Research-status Report
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26650076
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
中野 幹治 名古屋大学, 生命農学研究科, 研究員 (30636006)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ウズラ / ニワトリ / ES細胞 / 遺伝子組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニワトリのES細胞培養系を改変する事で，ウズラの胚盤葉細胞からウズラES様細胞の培養に成功した．この細胞は，哺乳類ES細胞に酷似した形態のコロニーを形成し，長期間の継代培養と凍結保存が可能であった．さらに代表的な未分化マーカーや多能性関連マーカーの発現を維持していると共に，初期胚に移植することでキメラ体を形成可能な多能性を有していることが分かっている．ウズラES様細胞は培養に使用するウズラの系統によって樹立の効率が大きく異なることが明らかとなったが，構築した培養系では複数の系統で同様の特徴を有した細胞が樹立可能であった．そのため，この培養系はニワトリ細胞にも応用可能ではないかと思われる．また，本研究で培養したES様細胞は，JAK/STATシグナルを阻害することで分化形態に形状が変化するが，FGFシグナルの阻害では影響が殆ど見られなかったことから，未分化維持機構はマウスやラットのES細胞のようにLIFシグナルに依存しているナイーブ型に近い性質を有していると思われる．
ニワトリES細胞では，染色体異常の発生がキメラ体における生殖系列伝播を阻害している一因であると考えられたが，ウズラES様細胞においても複数の細胞株で染色体異常が観察された．この染色体異常は，遺伝子導入の有無に関わらず検出されており，遺伝子操作によって引き起こされたのではなく，継代培養の積み重ねにより発生しているものと考えられる．そのため，キメラ体の作出には染色体異常が殆ど検出されない細胞株を使用することが肝要であり，現在，キメラ体作出までの培養日数，特に遺伝子操作とその後の選抜を短縮することを試みている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究計画では，平成27年度の段階で樹立したウズラES細胞を移植したキメラ体において，生殖系列キメラであることを判定する後代検定を実施する予定であった．しかし，ウズラES様細胞において，遺伝子操作の有無に関わらず染色体異常が複数の細胞株で検出され，その原因は培養日数の蓄積によるものと考えられた．そのため，染色体異常の発生を避けるために，より短い培養日数で樹立，遺伝子操作およびその後の細胞選抜を完了することが望ましい．ニワトリES細胞では，遺伝子操作後もキメラ体において生殖細胞系列への分化が確認できているものの，その後ES細胞由来の子孫は得られていない．その主要な原因の一つが移植細胞における染色体異常の発生と考えられるため，ニワトリのモデルとして利用予定であるウズラES様細胞において染色体異常を回避する手法を検証することは極めて重要であり，現在はそのための改良を行っている段階である．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では，今後ウズラES様細胞の樹立および遺伝子操作に必要な日数の短縮を試みた上で，キメラ体の作出を行い後代検定を実施していく．その際，遺伝子操作の前後で核型解析を行い，正常な核型を有していることを確認したうえで移植に使用する．なお，遺伝子操作は，CRISPR-Casシステムを利用したジーンターゲティングを主体として実施する．また，ウズラES様細胞を用いた成果を，ニワトリ細胞の培養にフィードバックし，新たなニワトリES細胞の樹立と遺伝子操作を実施する．さらに，ウズラと同様に核型解析を実施した後にキメラ体作出とその後の後代検定の実施に利用していく．以上の検証により，ウズラとニワトリでES細胞由来の遺伝子組換え個体を作出することが今年度の目標である．
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| Causes of Carryover |
ウズラES様細胞の培養において，染色体異常が複数の細胞株で検出されており，その改善として樹立および遺伝子操作に伴う培養日数の短縮を試みている段階であり，培養に必要な試薬や器具は当初の予定よりも必要となった．一方で，キメラ体の作出実験，特にニワトリ細胞の使用は停滞しており，それに伴って必要と計画していた孵卵機は購入しなかったため，当初の予定よりも使用額が少なくなり次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
キメラ体の作出実験を実施する上で，細胞を移植した胚を孵卵する孵卵機が必要であるが，ニワトリとウズラでは卵のサイズが異なるため，ニワトリ胚専用の新たな孵卵機を購入する（昭和フランキ:P-008(B)バイオ, \270,000）．また，染色体異常の発生を回避するため，ES細胞の樹立，遺伝子操作に伴う培養日数を短縮する条件をさらに検証するため細胞培養用の試薬，機器および細胞の特徴解析用抗体の購入に使用する．
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