2015 Fiscal Year Research-status Report
コンディショナルノックアウトシステムの導入によりイモリの再生能力を解明する
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26650082
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
竹内 隆 鳥取大学, 医学部, 教授 (70197268)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 発生 / 再生 / 心筋細胞 / イベリアトゲイモリ / トランスジェニック / コンディショナルノックアウト / CRE-loxP / 細胞系譜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、イモリを用いた遺伝子コンディショナルノックアウトシステムや遺伝子発現誘導システムを確立して、イモリの強力な再生能力が如何なる遺伝子の機能により成立するのかを解明するための研究基盤を構築すること、さらに構築した実験系を用いて、心臓再生に対する心筋細胞の増殖の寄与を明らかにすることにある。これらを達成する為に、（1）コンディショナルノックアウトイモリの作製と、その手法の効率化、（2）イモリゲノミックライブラリーとスクリーニングシステムの構築、（3）細胞増殖の再生時期特異的阻害および活性化により再生への影響を解析する実験を計画した。
今年度は計画に基づき、コンディショナルノックアウトイモリを作製するために、イモリCDK1遺伝子のイントロン領域に対するloxP配列の挿入実験を行った。加えて昨年度行った、IR-LEGO（赤外レーザー利用）法による局所的な遺伝子の発現誘導法について研究を進め、原著論文として国際学術誌に発表した。また、イモリゲノムから目的の配列をクローニングする手法の改良を行い、細胞増殖の可否を決定する鍵となるcyclin D遺伝子群の転写調節領域をクローニングすることができた。さらにクローニングした領域を用いたレポーターアッセイを行い、cyclin D遺伝子の転写活性化機構の研究と、再生時におけるcyclin D遺伝子と細胞増殖の関係について解析を行った。
これらの研究成果に関連して、原著論文を2報、総説論文1報、学会等の発表5件（うち招待講演4件を含む）と、著書（分担）の執筆2件を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画した３つの研究項目のうち、（1）コンディショナルノックアウトイモリの作製とその手法の効率化については、両生類で初めてとなる薬剤誘導型Cre-loxP組換えを介したノックアウト個体の作製を目指して研究を行ってきた。共同研究を行っているグループによって開発された新規のベクターを用いることで、イモリゲノムに対するloxP配列の挿入効率が上昇する可能性を示すことができた。組織特異的なプロモーターが利用できない状況下で遺伝子の発現を誘導するための対応として計画していたIR-LEGO法に対しては、イモリの再生実験にも有効であることを示して、成果の一部を論文として発表できた。（2）イモリゲノミックライブラリーとスクリーニングシステムの構築に関しては、これまでの本研究の成果により当初計画していた大腸菌人工染色体（BAC）を用いたイモリゲノミックライブラリーを作製せずとも、ゲノミックウォーキング法とインバースドPCR法さらにサザンハイブリダイゼーション法を組み合わせること、目的とするイモリのゲノム配列を効率的にクローニングする方法を確立できた。これにより、今年度は細胞増殖の可否を決定する鍵となるcyclin D遺伝子群の転写調節領域をクローニングすることができた。（3）細胞増殖の再生時期特異的阻害および活性化により再生への影響の解析については、（2）の研究成果によって得られたcyclin D遺伝子の転写制御領域の配列情報を利用して、その機能と細胞増殖の関係について解析を進めることができた。
このように、一部については計画の変更に伴う研究期間の延長が生じたものの、全体としては概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画にある方法で、イモリCDK1遺伝子座に対するloxP配列の挿入を試みてきたものの、予想に反してloxP配列の挿入効率が極めて低かった。そこで昨年度中に、新たに開発された特殊ベクターを用いる方法に方針を変更した。これを受けて、今年度は新規のベクターを用いて、イモリのCDK1遺伝子座に対するloxP配列の挿入を重点的に行う。挿入にあたっては複数のパターンのベクターを同時に試すことでより効率の良い条件を検討して研究のスピードをあげる。これによって作製される大量のコンディショナルノックアウト候補個体の選別法に関しては、当研究室で確立したイモリの遺伝子型を簡便かつ効率的に調べる手法をもちいる。さらにIR-LEGO（赤外レーザー利用）法による局所的な遺伝子の発現誘導法については、現在使用している熱ショックプロモーターを改良することでより厳密な発現制御を可能にすることを目指す。これらを確実に推進することにより、可能な限り早期にCDK1のコンディショナルノックアウトイモリを作製する。目的のイモリができた時点で実際に薬剤（タモキシフェン）処理を行い、心筋細胞特異的にCDK1遺伝子をノックアウトする。次にそのイモリの心臓を部分切除することで再生を誘起して、過程を解析することでCDK1が心臓再生と心筋細胞の増殖において担っている機能を解明する。
以上のような研究の推進方策により、研究目標の達成を目指す。
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| Causes of Carryover |
平成27年度は当初の計画に基づき、イモリCDK1遺伝子座に対するloxP配列の挿入を試みてきた。ところが予想に反して、loxP配列をコードする2本鎖DNAの断片とTALENを混合して用いる方法では、挿入効率が極めて低かった。そこで共同研究らとの協議を行い、新たに開発された特殊ベクターを用いることで導入効率を高める方法が有力であるとの結論に至った。loxP配列挿入の成否は、研究目的の達成にとり不可欠である。そこで研究計画の再検討を行い、研究期間を延長することとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度はイモリのCDK1遺伝子座に対する新規のベクターを用いたloxP配列の挿入を重点的に行う。挿入にあたっては複数のパターンのベクターを使用するため、それらの作製のための予算として活用する。これにより作製される大量のコンディショナルノックアウトイモリ候補の遺伝子型を調べるための試薬の購入、これらのイモリを適切に飼育・管理するための費用として使用する。さらに、CDK1コンディショナルノックアウトがイモリ個体に与える影響を解析するために必要な試薬を購入する。
このように、次年度に使用されることとなった研究費は研究目的の達成に向けて適正に用いる計画である。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Two inhibitory systems and CKIs regulate cell cycle exit of mammalian cardiomyocytes after birth.2015
Author(s)
Tane, S., Okayama, H., Ikenishi, A., Amemiya, Y., Nakayama, I. K., and Takeuchi, T.
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 466
Pages: 147-154
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Application of local gene induction by infrared laser-mediated microscope and temperature stimulator to amphibian regeneration study.2015
Author(s)
Kawasumi, A., Hayashi, T., Kobayashi, T., Nagayama, C., Hayashi, S., Kamei, Y., Morishita, Y., T Takeuchi, T., Tamura, K., Yokoyama, H.
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Journal Title
Dev. Growth Differ.
Volume: 57
Pages: 601-613
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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