2014 Fiscal Year Research-status Report
ライブイメージングと「くっつきアッセイ」～心皮合着過程の新しい解析手法の開発
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26650100
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
相田 光宏 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (90311787)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 植物 / 細胞・組織 / 発生・文化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心皮の接着のアッセイ法を確立するため、FAA固定、エタノール酢酸固定、および無固定の三種類の条件で調整した野生型サンプルについて臨界点乾燥を行い、金属蒸着処理後、Quanta 250電子顕微鏡の高真空モードを用いて観察を行ったところ、接触部の細胞が互いにひっばられたような形状を示した。また、金属蒸着処理を行わないサンプルでも同様の画像が得られたことから、この像は蒸着された金属によるアーティファクトではないことが明らかになった。さらに、この引っ張られた形状が細胞壁の何らかの成分を介した相互作用に夜ものかどうかを明らかにするため、固定前に心皮をPectolyase (Y-23)で処理した。処理後のサンプルと未処理のサンプルそれぞれについて臨界点乾燥・金属蒸着を行って高真空モードで観察したところ、処理したサンプルでは細胞同士がひっぱっられるような像がほとんど見られなくなった。一方、細胞同士が引っ張り合う形状は、本来の接着がおこらないがく片同士や、茎頂分裂組織とがく片の間、さらに心皮と雄蘂原基の間でしばしば観察され、その程度は若い組織であるほど大きくなっていた。このことは、細胞同士の引っ張りあう形状が、固定操作以後のどこかの段階で生じた可能性を示している。
さらに心皮融合部のライブイメージングを行うため、pATML1::NLS:3xEGFPおよびpATML1::CYCB1-N::NLS:3xEGFPの二種類のマーカーを用い、多光子レーザー顕微鏡（Leica SP5）を用いてイメージングを行った結果、接触部の良好な蛍光画像を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
くっつきアッセイについて細胞同士が引っ張られるような像が、Pectolyase処理によって消失することを示すことで、このような細胞の形状が細胞壁の成分に依存しておこることを明らかに出来、実際に細胞の接着の有無のアッセイとして利用できる見通しが開けた。また、pATML1::NLS:3xEGFPのマーカーを用いて、心皮接着部位の良好な共焦点画像を得ることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
くっつきアッセイにおいて、心皮の接触部以外での接着を抑制するため、これまでと異なる固定方法（グルタルアルデヒドｰオスミウム酸による固定）を検討する。また、蛍光染色による生組織を用いたくっつきアッセイ法も新に試みる。
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