光遺伝学法と単一細胞光刺激装置を用いて、ホヤ幼生中枢神経系の機能解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26650122
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 中川 将司 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (00212085)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 光遺伝学 / ホヤ幼生 / 神経回路 / 神経機能 / 行動

Outline of Annual Research Achievements

ホヤ幼生の中枢神経系は、僅か100個足らずの神経細胞から構成されている。非常にシンプルな神経系であるが、その機能解析はまだ殆どなされていない。光遺伝学的手法は、光照射で神経細胞を興奮させたり、抑制させたりでき、様々な動物で適用されている。ホヤ幼生においてもこの手法を試みてきた。特定の細胞タイプだけにチャネルロドプシンを発現させても、それらの細胞が密集して存在しているため、従来の光照射法では複数のニューロンを興奮させてしまう。その為、どのニューロンの発火が行動に結びついているのか同定することは不可能であった。光遺伝学的手法を適用するには、単一細胞だけを刺激するシステムが必要である。本研究では、単一細胞光刺激装置を作製し、それを用いてホヤ幼生の神経系の機能を明らかにする。
本年度の目標は、単一細胞光刺激装置の作製であったが、設計上の不備が見つかった。当初の設計では、刺激光を長焦点対物レンズで集光し被写体の位置でビーム径が最小になるものと考えていた。しかし、対物レンズに入射する光の高さが想定していた位置よりも高くなり、被写体の位置にフォーカスできないことが分かった。光学機器メーカの技術者と検討した結果、レーザ光を光ファイバーに入射し、ファイバアダプタを介してコリメートした光を長焦点距離対物レンズに入射することになった。3つレーザを同軸上合わせ、光ファイバーに入射するには、専門的技術が必要である。3つのレーザ光が被写体上で5 uｍ径のビームに絞り込むシステムをメーカで作製してもらうことになった。その為、予算の前倒し申請を行い、メーカ側と何度も機器の仕様及び価格交渉を行った。漸く、年度末に発注できるようになった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本来なら単一細胞光刺激装置が完成しているはずであった。上述したように、装置設計に不備が見つかった。その為、設計を見直し、また予算内に収まるようにメーカ側との交渉等に時間がかかり、年度末になって漸く装置を発注した。

Strategy for Future Research Activity

単一細胞光刺激装置は、5月中旬頃には納品される予定である。それを現有の倒立顕微鏡に設置し、被写体の位置で集光するように標本の位置の微調整を行う。レーザ光のパワー、パルス幅、パルス間隔等をコントロールするための電子機器を作製する。
ラベルタンパク質として、水溶性の光変換蛍光タンパク質、KaedeもしくはmKikGRを用いる。Kaedeタンパク質は明るいが４量体である。その為、4量体を形成するまでに時間が掛かるかもしれない。一方、mKikGRは単量体なので成熟するまでの時間が短いし、Kaedeに比べ素早く細胞内に拡散すると思われる。ホヤ幼生の両タンパク質を発現させ、どちらの蛍光タンパク質を用いるか、検討する。
これまで行ってきたCa2+イメージングでは幼生の上にアガーを載せて幼生全体を固定して、測定をしてきた。本実験では、尾部の運動をモニタする必要がある。幼生の胴体だけを固定し尾部がフリーになるような固定法を検討する。光刺激の条件（光強度、パルス幅等）を検討し、また光変換タンパク質の光照射方法も検討する。

Causes of Carryover

単一細胞光刺激装置の設計に不備が見つかり、再度設計し直した。それに伴い、装置の価格が大幅に上がり、予算内に収まるようにメーカ側との調整に時間が掛かった為、年度内に購入できなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

単一細胞光刺激装置は既に発注済で、5月中旬には納入される予定である。