光遺伝学法と単一細胞光刺激装置を用いて、ホヤ幼生中枢神経系の機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26650122
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 中川 将司 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (00212085)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 光遺伝学 / ホヤ幼生 / 神経回路 / 神経機能 / 行動

Outline of Annual Research Achievements

ホヤ幼生の中枢神経系は、僅か100個足らずの神経細胞から構成されている。特定の行動がどのようにして生じているのか、神経細胞レベルで調べることが可能であると思われる。本研究では、光照射により神経の発火を誘導できるチャネルロドプシンを用いて、特定の神経細胞を興奮させたときに生じる行動を観察し、神経回路とその出力である行動との関係を明らかにすることである。まずは一細胞レベルで光刺激を与えることができる単一細胞光刺激装置を開発した。光刺激用レーザのビーム径を10umに絞り込めるようにし、単一細胞レベルで神経細胞を興奮できるようになった。
本年度は、抑制性GABA/グリシン神経細胞をターゲットにした。小胞型GABA/グリシントランスポータ遺伝子のプロモータにチャネルロドプシン及び光変換蛍光タンパク質mKikGR遺伝子を連結させたコンストラクトを受精卵に導入し、GABA/グリシン神経細胞にチャネルロドプシンを発現させた。GABA/グリシン神経細胞は抑制性神経にも拘わらず、幼生全体に光を照射すると、幼生は活発に遊泳行動を起こした。次に、単一細胞光刺激装置を用いて細胞レベルで神経を興奮させたところ、脳胞部後方に位置するGABA/グリシン神経細胞に刺激光を照射したとき、激しい遊泳行動が発動した。この神経が遊泳行動を引き起こすのに重要な神経と思われる。
幼生後期（孵化後8時間以降）なると、幼生の遊泳運動が活発になる。その為、遊泳行動が自発的なものなのか、それとも光刺激に依るものか判定できない。そこで、自発遊泳を制御する方法を検討した。その結果、TRPチャネルの阻害剤であるAP-18を20 uM投与することで自発遊泳を抑制することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度に完成する予定であった単一細胞光刺激装置が、設計上の不備があり２年度まで持ち越された。この装置では照準用630nm、チャンネルロドプシン活性化用488nm及び光変換蛍光タンパク質の蛍光色変換する為の405nmレーザを長作動距離対物レンズで標的細胞に集光する予定であった。しかし、対物レンズの色収差によりフォーカス面が異なることに気付き、その補正方法見出した。結局、本格的に実験を始めたのは一昨年の暮れからになってしまった。ホヤは季節もので、8月から10月半ばまで間は実験ができない。最近、少しずつデータがでてきているものの、学生の研究指導に忙しくなり、期間内に十分な成果が出せなかったので、補助事業期間の延長を申請した。

Strategy for Future Research Activity

これまで、一つ神経細胞を光刺激で活性化し、その細胞がどの行動を引き起こすのかを見てきた。そして、脳胞後方部の抑制性GABA/グリシンニューロンを活性化すると幼生の遊泳行動を引き起こす現象が見られた。まだ例数が少ないので再現性の確認が必要だが、そのGABA/グリシンニューロンがどのニューロンと接続しているのかを、免疫染色法等で調べたい。
我々は、尾部前方部で、運動神経と接触しその軸索が左右に交差し、その終末が反対側の運動神経に接触する抑制性GABA/グリシンニューロンを見つけた。その単純な神経回路が尾部を左右に振る運動を引き起こすと我々は考えている。片側のGABA/グリシンニューロンを光活性化させると反対側の筋肉が弛緩し尾が同側に曲がるのか？また光活性化を解除すると、反対側の運動ニューロンが抑制性反跳(post-inhibitory rebound)によって、弛緩した側の筋肉が収縮するのかを観測し、この回路がCPGであることを検証する。

Causes of Carryover

特に理由はない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

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