2014 Fiscal Year Research-status Report
シダ植物におけるミトコンドリアゲノム全長解読と計算機科学的な「細胞分画法」の開発
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26650146
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| Research Institution | Japan Women's University |
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Principal Investigator |
大槻 涼 日本女子大学, 理学部, 研究員 (10646962)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シダ植物 / ゲノム / ミトコンドリア / 次世代シーケンス / ヤブソテツ / 無配生殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の次世代シーケンス技術の向上によって、大量の配列データをもとにした、遺伝マーカーの開発や活用が盛んに行われるようになってきた。しかし、シダ植物では未だに遺伝子間領域を含めたミトコンドリア全長配列解読の報告はなく、開発したマーカーの中に意図せずミトコンドリア領域のマーカーを設計してしまう可能性があった。そこで、本研究は、次世代シーケンスを活用し、効率良くミトコンドリア全長配列を決定することを目的としている。研究材料は三倍体無配生殖型ヤブソテツ（Cyrtomium fortunei オシダ科 シダ植物）を用いる。
ミトコンドリアゲノムの全長配列は２通りの方法で決定する。その２通りとは（１）核・葉緑体・ミトコンドリアなど細胞をそのまま破砕し、次世代シーケンサーから得られたDNAを全ゲノムをデータから、ミトコンドリア配列のみをパソコン上の計算結果から抽出し推定する方法と、（２）細胞分画法によってミトコンドリアを選択的に抽出し、そこから配列を再構築する方法である。もし推定が正しければ、（１）と（２）の結果は同じになるはずである。
今年度は上記のうち、（１）の次世代シーケンスから取得したデータのみからパソコン上でミトコンドリア配列を推定することに挑戦した。栽培環境下にあったヤブソテツ株からDNAを抽出し、そこからIllumina Hiseq 2000とPacBio RS IIの異なるプラットフォームからデータを取得した。得られた解析前の配列データは、Illuminaからは34 Gbp、PacBioからは1 Gbpであった。このデータから配列をアセンブルによってゲノムを再構築した。アセンブルの結果、オルガネラのうち葉緑体全長（約150 kbp）と、ミトコンドリアに含まれる主要な遺伝子について決定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、ヤブソテツ（オシダ科 シダ植物）のミトコンドリアゲノムの全長配列を２通りの方法で決定し、さらにオルガネラゲノムの推定法を開発することを目的としている。今年度は、このうちの次世代シーケンサーから得られたDNAを全ゲノムをデータから、ミトコンドリア配列のみをパソコン上の計算結果から抽出し推定する方法の開発を行った。
春先の天候不順から、研究材料の栽培株の枯死も考えられたが、栽培条件と実験条件の検討により最適な時期に高品質のDNAを抽出することができた。次世代シーケンスによる解析は当初の計画よりも確実性を重視し２つのプラットフォームを活用することができた。得られたデータをもとに解析した結果、オルガネラのうち葉緑体全長（約150 kbp）と、ミトコンドリアに含まれる主要な遺伝子について決定することに成功した。しかし、ミトコンドリア全長配列の決定に必要な、遺伝子間領域の情報はまだ十分ではないことも分かってきた。その理由として、これまでに得られたデータ量だけではまだ十分ではない可能性と、植物のミトコンドリア配列に見られるマルチパータイト構造（複数の配列長のDNAが混在する状態 、場合によては環状でない配列も含まれる場合がある）によって計算結果が収束していない可能性も示唆されている。この問題については次年度に行う細胞分画法を使った解析で十分に解決できるものと考えられる。さらに、これまでに得られた結果をもとに新たな解析方法を開発する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2015年度は研究計画の後半部分、これまでに得られた結果とは独立に、細胞分画法を活用してミトコンドリアのみを抽出し、これをもとに次世代シーケンスにより配列を決定する予定である。解析に必要な実験条件の検討の一部をすでに開始しており、材料となる植物体の成長に合わせて実験を開始する予定である。
順次、決定できた配列について、既存のデータベースとの相同性検索と注釈付け（アノテーション）を行い、データベースへの登録を進めていく。また、開発したミトコンドリア配列推定の手法について公開できるように準備を進める。
これまでに判明した課題として、計算能力の問題がある。取得した次世代シーケンスのデータ量と計算結果の増大により、計算能力の増強も必要になりつつある。国立遺伝学研究所の大容量スーパーコンピューターの利用申請など、新たな研究申請や共同研究も考慮する必要がある。
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| Causes of Carryover |
春先の天候不順により植物体の採集とDNAの抽出計画に変更があったため当初検討していた物品の購入などを見送る必要があったため。また、解析結果の公開について、得られた結果に不足分が示唆されたために計画に変更があった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次世代シーケンスによる解析の回数を当初の計画よりも増やす予定である。これにより、より確実な結果が得られることが期待される。さらに解析を進めることに伴うデータ量の増大と計算結果の検算により、今までの計算能力では不足することが考えられるため、必要な機器の使用も検討している。
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