カキ果実のプロアントシアニジンとそのポリマーの生成蓄積機構解明のための新技術開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660026
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 米森 敬三 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10111949)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 園芸学 / カキ / タンニン / 細胞・組織

Outline of Annual Research Achievements

カキは、果実内のタンニン細胞にプロアントシアニジンのポリマー（縮合型タンニン）を多量に蓄積するために強い渋味を呈する。しかしながら、カキ果実内でのプロアントシアニジンの生成部位やタンニン細胞の分化･発達過程に関する基本的な知見はこれまでにほとんど得られていない。本研究は、プロアントシアニジンの組織･細胞内局在性解析に共焦点レーザー顕微鏡が有効であるとの報告があることから、カキ果実にこの方法を適用することで、カキ果実の縮合型タンニンの生成･蓄積機構を組織化学的に解明することが出来る新技術を開発することが目的である。
本年度は、縮合型タンニンと特異的に結合すると報告されている蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinにより染色したカキ果実の新鮮切片を共焦点レーザー顕微鏡で観察するための最適条件を得ることを目的に、新鮮切片への染色時間、染色後の切片の水洗時間などを検討した。その結果、当然のことながら、染色時間が長くなると蛍光強度が強すぎるため、染色液の濃度にもよるが、2～3分間の染色で十分であった。ただ、染色後の水洗は不可欠であり、数分間の水洗は最適な蛍光強度による観察のために必要であることが明らかとなった。また、この蛍光色素はカキ果実細胞の細胞壁と強く結合するようであり、長時間水洗しても、共焦点レーザー顕微鏡での観察で細胞壁には強い蛍光が認められた。しかしながら、この事実はタンニン物質がカキ果実で細胞壁に多く存在しているためか、単にカキ果実の細胞壁成分とこの蛍光色素が結合する性質があるためかが判断できず、この点を次年度に再度検討する必要が生じた。なお、果実組織を固定・包埋したサンプルでのこの色素の有効性を調査するため、経時的にサンプルを採取する予定であったが、新鮮組織の観察結果を確かめる必要が生じたため、それらを経時的に採取するまでには至らず、この点も次年度の課題となった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究ではこれまで使用したことがなかった共焦点レーザー顕微鏡を扱ったが、この操作に習熟するまでに時間を費やした。また、本研究で使用した蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinは縮合型タンニンと特異的に結合するとされていたが、カキ果実細胞の細胞壁とも強く結合することが共焦点レーザー顕微鏡の観察から明らかとなり、この原因が縮合型タンニンが細胞壁に蓄積しているためか、あるいは単に細胞壁と結合する性質があるためかを確認することが最後まで出来なかった。これらのことを検討するために多くの時間を費やし、当初計画していた固定・包埋した組織を経時的に作製することが出来なかった。本年度、共焦点レーザー顕微鏡を用いた新たな蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinでのカキ果実の組織観察を実施できたことは大きな進展であるが、全体の計画と照らし合わせた場合、本年度の達成度はやや遅れていると考えている。

Strategy for Future Research Activity

人為的な脱渋処理や樹上での自然脱渋によってカキ果実が渋味を消失した場合、あるいはプロシアニジンの生成が認められなくなった場合の果実において、その果実から新鮮切片を作成し、蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinで染色した場合にどのように染色されるかを検討することで、本年度、細胞壁で認められたOregon Green 488-conjugated gelatinの結合が、細胞壁のタンニンの存在によるのかどうかを検討する。さらに、完全甘ガキおよび非完全甘ガキ品種の果実を経時的に採取後、固定・包埋した試料を作製し、この試料を用いてタンニン細胞の発育過程を確認するとともに、これらの試料での蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinの縮合型タンニン局在性解析の可能性を調査する。さらに、カキの近縁二倍体種マメガキは、カキと比較すると果実内に多量のタンニン細胞が存在しているため、このマメガキ果実を用いてタンニン細胞の分化過程を解析できる可能性がないかを検討する。

Causes of Carryover

当初はカキ果実の組織を固定・包埋したサンプルを経時的に作製し、これらの試料を用いて蛍光色素Oregon Green 488-conjugated gelatinの固定サンプルでの有効性も詳細に調査する計画であった。しかしながら、前述のように、新鮮組織でのこの蛍光色素の有効性を検討することに手間取り、経時的なサンプル採取を実施することが出来なかった。このため、この試料作製に予定していた樹脂包埋用試薬や包埋機材などの経費を使用していないため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

来年度は、カキ果実の組織を固定・包埋したサンプルを経時的に作製する計画であるので、このための経費として使用する。また、カキの近縁野生種であるマメガキを用いたタンニン細胞分化過程の解析を新たに実施する予定であるため、そのための経費の一部としても使用することを考えている。