2014 Fiscal Year Research-status Report
岩石内微生物の探索とその生存戦略および環境中における役割の解明
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26660058
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
宮永 一彦 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (40323810)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 微生物叢解析 / 生菌 / 16S rRNA遺伝子 / エチジウムモノアジド(EMA) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，様々な環境から岩石を採取し内部の微生物叢について解析することを目的としている。近年の微生物叢解析は細菌由来の16S rRNA遺伝子配列を指標とする遺伝子工学的手法が用いられている。しかし，従来の方法では全菌由来のゲノムを用いるため，生菌および死菌の区別をすることができず，環境試料中で活性を有する微生物を評価するためには，生菌の群集解析をする必要がある。
そこで，今年度は生菌由来の16S rRNA遺伝子を解析する手法の検討をおこなった。死菌の細胞膜を選択的に透過し，死菌中のDNAに結合して不活化することでPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を阻害する薬剤(EMA: エチジウムモノアジド)あるいはDNAを切断する酵素(DNase)を用いて，生菌のDNAのみを増幅する手法について検討をおこなった。
予備実験より，岩石内に微生物が存在することは明らかになっているが，河川水，土壌などの他の環境試料と比較してその絶対量は非常に少ない。そのため，最初に純粋菌２種類(大腸菌[グラム陰性菌]および黄色ブドウ球菌[グラム陽性菌])および複合微生物系の試料として都市下水処理場由来の活性汚泥を用いて16S rRNA遺伝子の定量PCRをおこない，処理条件を検討した。その結果，DNase処理は処理の有無によって16S rRNA遺伝子のコピー数に大きな違いが見られなかった。一方，0.1 mg/mLのEMA処理において，処理有りの場合に16S rRNA遺伝子のコピー数が処理無しの場合より少なかったことより，EMAが死菌の細胞膜を透過して死菌由来の16S rRNA遺伝子のPCRを阻害したものと考えられる。これらの結果より，EMA処理後にPCR増幅された16S rRNA遺伝子は生菌由来であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書の「研究目的」では，今年度に様々な環境から岩石を採取し内部の微生物叢解析を行う予定であると記載した。しかしながら，微生物叢解析手法が確立しない段階で解析をおこなった場合，結果の解釈が困難になるものと考え，まずは解析手法の確立に注力した。また，概要でも述べたが，目的試料である岩石内の微生物量は非常に少ないため，今年度は再現性を重視し，微生物量が安定して得られる純粋菌および複合微生物系の代表として活性汚泥を試料として用いた。そのため，今年度は予定していた各環境中の岩石からの遺伝子抽出および微生物叢解析には至らなかったが，次年度に今年度確立した手法を用いて，各環境中の岩石内の微生物叢解析をおこなう予定である。また，活性汚泥を試料とした今年度の結果より，EMA処理の有無によって割合が異なる微生物種が存在していることが明らかとなった。このことは，EMA処理をおこなった場合に全体の系に占める割合が減少した微生物種は，EMAによってPCRが阻害されたものであるため，実際の環境中では死滅あるいは細胞膜が損傷していると考えられる。これらは，従来の方法では生菌と同様にPCR増幅されていたと考えられるため，主に実際の環境中で評価をしなければならないのは，EMA処理の有無によらずPCR増幅された種であると思われる。よって，次年度に岩石内の微生物に関しても同様の手法が適用できるため，(今年度は試料として岩石は用いていないが)進捗状況はほぼ予定通りであると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
概要で述べた通り，生菌由来の16S rRNA遺伝子を解析する手法の検討をおこない，EMA処理を適用することで死菌由来の遺伝子のPCRを阻害し，生菌由来の16S rRNA遺伝子の解析が可能となることが示唆された。そこで，今後は本手法を，様々な場所に存在する岩石について適用し，実環境中で生存している微生物叢の解析をおこなう予定である。まず最初に，環境因子の影響が少なく微生物叢の違いが小さいと考えられる岩石試料について，再現性の確認おこなう。つまり，同じ場所に存在する同種の岩石間では内部の微生物叢の差が小さいと考えられるため，岩石毎(もしくは解析毎)に微生物叢が大きく異なる場合，手法による誤差によるところが大きいと考えられる。誤差が大きい場合は，試料採取方法およびゲノム抽出方法など，再度詳細に検討しなければならない課題である。
また，16S rRNA遺伝子を用いた微生物叢解析だけでは各種微生物の機能を知ることは不可能である。そのため，16S rRNA遺伝子解析により岩石内の存在が明らかとなった主な微生物種(例えば，環境を問わず普遍的に存在する種，あるいは特殊な環境にのみ存在する種，など)に着目し，代謝に係わる機能遺伝子等についてもデータベースを基にプライマーを設計し，検出および定量を行っていきたいと考えている。さらに，回復(復元)培地を用いて培養可能な種の分離・同定を行い，それらが16S rRNA遺伝子解析における生菌と相関があるかを調べる。また，培養可能な菌種の環境ストレス(温度，栄養条件など)に対する増殖特性・生存特性についても解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
申請時点では，今年度に様々な環境から岩石を採取し内部の微生物叢解析を行う予定であったが，微生物叢解析手法が確立しない段階で解析をおこなった場合，結果の解釈が困難になるものと考え，まずは解析手法の確立に注力した。そのため，試料数が限られており業者に依頼解析(16S rRNA遺伝子の次世代シーケンス解析)をおこなわなかったため，当初予定していた微生物叢解析にかかる費用(次年度使用額の約３分の２)よりも支出が少なかった。さらに，試料採取のための移動による交通費も，今年度は研究機関周辺からの採取であり，大きくかからなかった。また，本研究にのみ用いるような特殊な試薬・消耗品類や高額な測定装置は特になく，現有の試薬・消耗品，測定装置を共有可能な実験が主であったことも，本年度の支出が予算より少なかった一因であると考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
概要でも述べたが，目的試料である岩石内の微生物量は非常に少ないため，今年度は再現性を重視し，微生物量が安定して得られる純粋菌および複合微生物系の代表として活性汚泥を試料として用いた。そのため，今年度は予定していた各環境中の岩石からの遺伝子抽出および微生物叢解析には至らなかったが，次年度に今年度確立した手法を用いて，各環境中の岩石内の微生物叢解析をおこなう予定である。試料数が増えるため，今年度予定していた16S rRNA遺伝子の次世代シーケンスの受託解析に用いる予定である。また，成果発表を行う予定である学会発表に際し，学会開催地で試料を採取するなど，採取場所にも多様性を持たせるようにしたいと考えている。
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Research Products
(2 results)
