2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26660064
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小川 順 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (70281102)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日比 慎 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (30432347)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 応用微生物 / 核酸 / 進化 / 発酵 / 酵素 / デオキシリボヌクレオシド / DNA / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、deo経路によるデオキシリボヌクレオシド（dNS）逆合成系が生細胞内でribonucleotide reductase（NRD）機能を代替しうるかどうかを検証する。昨年度は、大腸菌（BW38029株）が有する３種のNRD（nrdAB、nrdEF、nrdDG）のうち、必須遺伝子とはされていない２種のNRD (nrdEF、nrdDG）ならびに、ゲノム上のdeo遺伝子を除去した三重遺伝子欠損株を構築し、この三重遺伝子欠損株にdeo遺伝子をプラスミドで導入することで、deo遺伝子の発現を人為的に制御できる株（Δ3/pBRdeo）を構築した。本年度は、Δ3/pBRdeo株におけるnrdABの破壊を試みたが、必須遺伝子であるnrdABの破壊株は得られなかった。そこで、Δ3/pBRdeo株に残存するnrdAB由来のdNS合成活性をNRD阻害剤であるhydroxyurea（HU）にて阻害する条件下で、dNS逆合成系が実際に機能してΔ3/pBRdeo株の生育を担保できるかを検証した。まず、Δ3/pBRdeo株が、生育を阻害する濃度のHU存在下にてデオキシリボース要求性を示すことを確認した。続いて、dNS逆合成系の基質となるグルコース、アセトアルデヒドの添加を検討したが、アセトアルデヒドの毒性が高く生育を確認できなかった。これを回避すべく、ピルビン酸デカルボキシラーゼを共発現し、ピルビン酸添加による間接的なアセトアルデヒド供給系をΔ3/pBRdeo株に組み入れたΔEF/ΔDG/Δdeo(pACYC-pdc/pBR-deo)株を構築した。本菌株は、Δ3/pBRdeo株の生育を阻害する濃度のHU存在下、グルコース、ピルビン酸のみを炭素源とする完全合成培地にて生育可能であったことから、dNS逆合成が生細胞内でNRDの機能を代替しうる可能性が示された。
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