脂溶性分子シャペロンとしての高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660065
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 川本 純 京都大学, 化学研究所, 助教 (90511238)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 特殊環境微生物 / 低温菌 / 高度不飽和脂肪酸 / エイコサペンタエン酸

Outline of Annual Research Achievements

南極海水より単離された低温適応細菌 Shewanella livingstonensis Ac10 は低温誘導的に高度不飽和脂肪酸の一種であるエイコサペンタエン酸（EPA）を生産する。本菌において EPA は細胞膜を構成するリン脂質のアシル鎖として存在し、生体膜の膜圧や弾性、曲率といった物理化学的特性に影響し、膜タンパク質の機能発現に関与していることが予想されている。EPA 含有リン脂質を含む人工膜にモデルタンパク質である Omp74 を再構成したとき、EPA は本タンパク質の膜への挿入と高次構造形成を促進する分子シャペロン的な機能を有することが示された。本研究では生理的条件下における、EPA による膜タンパク質の構造形成や機能発現への影響を解析するために、本菌で生合成される EPA の可視化に取り組むことで、EPA と相互作用するタンパク質の探索を試みた。内在性 EPA を可視化するために、キャリアータンパク質に EPA を架橋することで調製した EPA 抗原を調製し、ラットに接種した。免疫後のラットから、脾臓を回収し、ミエローマ細胞との細胞融合により抗 EPA 抗体産生性ハイブリドーマを獲得した。得られた新規の抗 EPA 抗体は、オレイン酸とは相互作用しないが、EPA に対して特異的に結合する抗体であることがわかった。本抗体をもちいて S. liviingstonensis Ac10 を免疫蛍光染色法に供した結果、本菌の核様体閉鎖領域に EPA に由来する蛍光シグナルが検出された。一方で、EPA 生合成遺伝子を破壊した EPA 欠損株からは蛍光シグナルが得られなかったことから、本菌において EPA は細胞分裂部位に特異的に濃縮していることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、低温菌における EPA 含有リン脂質を介したタンパク質の効率的な構造形成を活用することで、膜タンパク質の高生産系の開発を目指すものである。本年度、本菌における EPA の細胞内局在を解析するために、新規の抗脂肪酸抗体の作製に成功した。その結果、これまでに報告例のない EPA によって構成されるマイクロドメインの存在を示すことができた。EPA が濃縮したドメインは他の脂肪酸で構成される膜領域とは物理化学的特性が顕著に異なるドメインと考えられ、膜タンパク質の構造変化や複合体形成といった膜内での分子内、分子間相互作用を制御するドメインと考えられた。以上の結果は、本菌をもちいた膜タンパク質生産系を効率化させる分子基盤である可能性が高く、本研究は概ね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

現在、EPA を特異的に認識する抗 EPA 抗体の作製に成功している。一方で本研究で獲得された抗 EPA 抗体産生性ハイブリドーマの抗体産生能は不安定であることがわかった。抗 EPA 抗体は本実験を遂行するうえで、必要付加可決なツールであることから、安定的に抗体を産生するハイブリドーマの樹立を目指す。現在、獲得している抗 EPA 抗体産生性ハイブリドーマから cDNA を調製し、抗体の可変領域をコードする遺伝子領域を決定する。得られた配列から CHO 細胞をもちいた抗 EPA 抗体高生産株を樹立する。併行して、すでに獲得している抗 EPA 抗体をもちいて、EPA と相互作用するタンパク質を探索し、EPA との分子間相互作用機構を明らかにする。

Causes of Carryover

本研究では内在性 EPA を可視化するツールとして、新たに EPA を特異的に認識する抗 EPA 抗体の作製に取り組んだ。本抗体は、本菌における EPA の可視化用ツールとして有効であることが示され、その他、EPA 生産量の解析や EPA と相互作用する分子の探索などに応用可能な汎用性の高いツールであるといえる。一方で、本研究で獲得した抗 EPA 産生性ハイブリドーマの抗体産生能は不安定であり、恒常的に抗 EPA 抗体を産生することは困難であった。そこで、安定的な抗体産生株の樹立を目的とし、当初予定していなかった抗体の可変領域をコードする遺伝子配列の決定と、組換え型抗体産生株を樹立する必要が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

抗 EPA 抗体を安定的に獲得するためのクローニング、および CHO 細胞を宿主とした組換え型抗体産生株を樹立する。より力価の高い抗 EPA 抗体の獲得を目標に、架橋様式の異なる EPA 抗原を作製し、ラットに免疫する。他の脂肪酸、特にアラキドン酸やドコサヘキサエン酸といった高度多価不飽和脂肪酸と EPA を認識する抗体の獲得を目指す。得られた抗体をもちいて、本菌における EPA の可視化、それに加えて免疫沈降法により、 EPA と相互作用するタンパク質の探索・同定を行う。次年度に繰り越した使用額については、抗 EPA 抗体の遺伝子工学的な解析と高機能化、および組換え型細胞の培養に用いる。