2014 Fiscal Year Research-status Report
還元型PQQ生成酵素を求めて：生理機能不明及び新規PQQキノプロテインの機能解析
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26660068
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 尚也 山口大学, 農学部, 助教 (50713509)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 還元型PQQ / キノプロテイン / PQQ / Acinetobacter / 酢酸菌 / 酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌の膜結合型キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素（GLDH）は種々の糖アルコールの酸化反応を担うことが明らかになっているが，アポ型酵素が多くの割合で存在し，そのPQQ易脱離性の原理および理由が明らかになっていない。また、Acinetobacterの水溶性キノプロテイン・グルコース脱水素酵素（sGDH）は，ペリプラズムに存在する酸化還元酵素でありながら，その電子受容体が見つかっておらずその機能がわかっていない。そこで、本年度は、両酵素の機能を解明するために、以下の研究を展開した。
１．酢酸菌GLDHの機能解析とその精製に向けて
Gluconobacter frateurii CHM43株とGluconobacter thailandicus IFO3255株から細胞膜を調製し、GLDH活性の比較検討を行ったところ、両株ともCaで活性化される酸性側（至適pH 5）の活性とMgで活性化されるアルカリ側（至適pH 8）の活性をもつが、CHM43株の方がより強く安定な活性を有していた。そこで，CHM43株について、そのGLDH遺伝子破壊株を作成し、酸性とアルカリの両活性がGLDH破壊によって消失することを明らかにした。続いて、より詳細な解析を進めるために、細胞膜からの本酵素を可溶化を試みたが、その活性の不安定性と非常に高濃度にアルコール脱水素酵素（ADH）が同時に可溶化されてきで、GLDHの分離を妨げることが明らかとなった。そこで、CHM43株のADH遺伝子破壊株を作成した。現在、得られたADH破壊株を基に、GLDHの可溶化・精製の準備を進めているところである。
２．Acinetobacter sGDHの機能解析
Acinetobacter calcoaceticusのsGDHを大腸菌高発現株から精製した。現在，その精製酵素を用いて，(1) 酵素ターンオバー時の触媒活性の減衰について解析を始めたばかりであり，今後，(2) PQQ添加の有無における反応動力学の解析，(3) 酵素反応時におけるPQQH2生成反応の解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
酢酸菌のGLDHの解析に向けて、菌株の選定、GLDH機能（酸性とアルカリの両活性）の特定するためのGLDH破壊株の作成と順調に来たが、GLDHの可溶化・精製にADHが妨害することが判明した。そのため、ADH破壊株を作成しなければならず、その作成に時間を取られ、精製までに至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ADH破壊株が作成できたので、今後GLDHの可溶化・精製が順調に進むと期待している。また、sGDHは大腸菌高発現株から精製できているので、今後その解析も進むものと期待している。
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