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2015 Fiscal Year Research-status Report

還元型PQQ生成酵素を求めて:生理機能不明及び新規PQQキノプロテインの機能解析

Research Project

Project/Area Number 26660068
Research InstitutionYamaguchi University

Principal Investigator

松下 一信  山口大学, 農学部, 教授 (50107736)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 片岡 尚也  山口大学, 農学部, 助教 (50713509)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsPQQ / キノプロテイン / 還元型PQQ / 酢酸菌
Outline of Annual Research Achievements

酢酸菌の膜結合型キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素(GLDH)は,PQQの外れたアポ型に成りやすく、それが酵素の不安定要因となっているが、PQQ易脱離性の原理および理由が明らかになっていない。一方で,Acinetobacterの水溶性キノプロテイン・グルコース脱水素酵素(sGDH)は,ペリプラズムに存在する酸化還元酵素でありながら,その電子受容体が見つかっていない。そこで,昨年度に引き続き、両酵素の機能を解明するために、以下の研究を行った。
1.酢酸菌GLDHの精製とその機能解析
昨年度は、酢酸菌Gluconobacter frateurii CHM43のGLDH高発現株からその精製を妨害するアルコール脱水素酵素(ADH)の欠損株を作成した。そこで,本年度はその細胞膜からのGLDHの可溶化・精製を試み,ほぼ不純物を含まない精製酵素を得ることができたが、予想どおりアポ型が多く非常に不安定なため、その後の機能解析には進めていない。そこで、CHM43よりその比活性,特にアルカリ側活性、が劣るものの、安定酵素が得やすいGluconobacter thailandicus IFO3255株の精製して,本酵素が有する2つの至適pH(酸性,アルカリ性)におけるPQQの結合キネティックス解析を行った。その結果、本酵素のPQQ結合親和性がpH8.0でpH5.0に比べ、Ca/Mgいづれの存在下でも33-34倍低いことが明らかとなった。
2.Acinetobacter sGDHの機能解析
大腸菌高発現株から精製したsGDH(アポ型酵素)を用いて,PQQ添加後の酵素活性をpH6.5及び8.5で測定し、その活性に及ぼす活性酸素除去系(SODもしくはMn) の影響を調べた。その結果、活性酸素除去系因子がpH6.5の活性を若干促進するのに対し、pH8.5の活性を大幅に阻害することが明らかとなった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

酢酸菌Gluconobacter frateurii CHM43のADH欠損株の細胞膜から、GLDHの可溶化・精製し,ほぼ精製酵素を得ることができたが、非常に不安定なため、CHM43株の酵素を使った機能解析ができておらず、Gluconobacter thailandicus IFO3255株からの精製酵素を使って解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、CHM43のGLDHの安定酵素の取得を試みるが、もしそれが得られない場合は、IFO3255株の精製酵素を用いた解析を進める。また、sGDHの精製酵素からの解析では、活性酸素がアルカリ側の活性に関係するとする興味ある現象が見つかったので、その周辺を注意深く解析してゆく予定である。

  • Research Products

    (14 results)

All 2016 2015

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 6 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Genomic analyses of thermotolerant microorganisms used for high-temperature fermentations.2016

    • Author(s)
      Kazunobu Matsushita, Yoshinao Azuma, Tomoyuki Kosaka, Toshiharu Yakushi, Hisashi Hoshida, Rinji Akada, Mamoru Yamada
    • Journal Title

      Biosci Biotechnol Biochem.

      Volume: 80 (4) Pages: 655-668

    • DOI

      10.1080/ 09168451.2015.1104235

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Efficient Production of 2,5-Diketo-D-Gluconate via Heterologous Expression of 2-Ketogluconate Dehydrogenase in Gluconobacter japonicus.2015

    • Author(s)
      Kataoka N, Matsutani M, Yakushi T, Matsushita K.
    • Journal Title

      Appl Environ Microbiol.

      Volume: 81 (10) Pages: 3552-3560

    • DOI

      10.1128/AEM.04176-14

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A functionally critical single nucleotide polymorphism in the gene encoding the membrane-bound alcohol dehydrogenase found in ethanol oxidation-deficient Gluconobacter thailandicus.2015

    • Author(s)
      Charoenyingcharoen P, Matsutani M, Yakushi T, Theeragool G, Yukphan P, Matsushita K.
    • Journal Title

      Gene

      Volume: 567 (2) Pages: 201-207

    • DOI

      10.1016/j.gene.2015.04.080

    • Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Adaptive mutation related to cellulose producibility in Komagataeibacter medellinensis (Gluconacetobacter xylinus) NBRC 32882015

    • Author(s)
      Matsutani M, Ito K, Azuma Y, Ogino H, Shirai M, Yakushi T, Matsushita K.
    • Journal Title

      Appl Microbiol Biotechnol.

      Volume: 99 (17) Pages: 7229-7240

    • DOI

      10.1007/s00253 -015-6598-x

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A novel Na+(K+)/H+ antiporter plays an important role in the growth of Acetobacter tropicalis SKU1100 at high temperatures via regulation of cation and pH homeostasis.2015

    • Author(s)
      Soemphol W, Tatsuno M, Okada T, Matsutani M, Kataoka N, Yakushi T, Matsushita K.
    • Journal Title

      J Biotechnol.

      Volume: 211 Pages: 46-55

    • DOI

      10.1016/j.jbiotec.2015.06.397

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Complete genome and gene expression analyses of Asaia bogorensis reveal unique responses to culture with mammalian cells as a potential opportunistic human pathogen.2015

    • Author(s)
      Kawai M, Higashiura N, Hayasaki K, Okamoto N, Takami A, Hirakawa H, Matsushita K, Azuma Y.
    • Journal Title

      DNA Res.

      Volume: 22 (5) Pages: 357-366

    • DOI

      10.1093/dnares/dsv018

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Acetic acid bacteria: A group of bacteria with versatile biotechnological applications2015

    • Author(s)
      Saichana N, Matsushita K, Adachi O, Frebort I, Frebortova J.
    • Journal Title

      Biotechnol Adv.

      Volume: 33 (6-2) Pages: 1260-1271

    • DOI

      10.1016/j.biotechadv. 2014.12.001

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Gluconobacter frateurii CHM43の耐熱化に関する多剤耐性輸送体の機能解析2016

    • Author(s)
      松本奈実、服部浩美、松谷峰之介、外山博英、片岡尚也、薬師寿治、松下一信
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度年会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] Acetobacter pasteurianus SKU1108株の高温適応化株TH-3の発現・機能解析から見える耐熱性機構2016

    • Author(s)
      松下一信,松谷峰之介,西倉慎顕,秦野智之,サイチャナナツラン,マスードウライワン,服部浩美,貝沼(岡本)章子,兼崎 友,石川森夫,片岡尚也,薬師寿治
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度年会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] 酢酸菌Acetobacter pasteurianus 12株のゲノム情報と耐熱性との相関に関する解析2016

    • Author(s)
      松谷峰之介,山下隆司,古川藍子,辰野真木,貝沼(岡本)章子,石川森夫,志波優,吉川博文,平川英樹,薬師寿治,松下一信
    • Organizer
      第10回日本ゲノム微生物学会年会
    • Place of Presentation
      東工大(東京都目黒区)
    • Year and Date
      2016-03-04
  • [Presentation] 酢酸菌の耐熱性に関わる新規Na+ (K+) /H+ antiporter・NhaK2の構造と機能2015

    • Author(s)
      古川藍子,辰野真木,松谷峰之介,Wichai Soemphol*, 片岡尚也,薬師寿治, 松下一信
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会第41回研究会
    • Place of Presentation
      東大医学部(東京都文京区)
    • Year and Date
      2015-12-21 – 2015-12-23
  • [Presentation] 酢酸菌Acetobacter pasteurianus IFO 3283株の高温適応育種と耐熱化遺伝子解析2015

    • Author(s)
      松本奈実、松谷峰之介、東慶直、薬師寿治、松下一信
    • Organizer
      酢酸菌研究会第7回研究集会
    • Place of Presentation
      東京大学農学部(東京都文京区)
    • Year and Date
      2015-10-10
  • [Presentation] 耐熱性酢酸菌Acetobacter pasteurianus SKU1108 (NBRC 101655) 株の完全長ゲノム配列の決定および比較ゲノム解析2015

    • Author(s)
      松谷峰之介、平川英樹、薬師寿治、松下一信
    • Organizer
      酢酸菌研究会第7回研究集会
    • Place of Presentation
      東京大学農学部(東京都文京区)
    • Year and Date
      2015-10-10
  • [Presentation] Characterization the cytoplasmic membrane proteases involved in high temperature growth of thermotolerant Acetobacter tropicalis SKU11002015

    • Author(s)
      Wichai Soemphol, Minenosuke Matsutani, Naoya Kataoka, Toshiharu Yakushi, Hirohide Toyama, Kazunobu Matsushita
    • Organizer
      International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products with joint sessions from JSPS - NRCT New Core to Core Program Advance Research Networks
    • Place of Presentation
      Centara Hotel & Convention Center, Khon Kaen, Thailand
    • Year and Date
      2015-07-29 – 2015-07-31
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2017-01-06  

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