2016 Fiscal Year Annual Research Report
Functional analysis of physiological function-unknown or novel quinoprotein to seek an enzyme generating reduced PQQ
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26660068
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
松下 一信 山口大学, 創成科学研究科, 教授(特命) (50107736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 尚也 山口大学, 創成科学研究科, 助教 (50713509)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | PQQ / キノプロテイン / 酢酸菌 / sGDH / Glycerol Dehydrogenase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Acinetobacterの水溶性キノプロテイン・グルコース脱水素酵素（sGDH）は，ペリプラズムに存在する酸化還元酵素でありながら，その電子受容体が見つかっていない。一方，酢酸菌の膜結合型キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素（GLDH）は種々の糖アルコールの酸化反応を行うが，アポ型酵素が多くの割合で存在し，PQQ易脱離性の原理および理由が明らかになっていない。そこで，昨年度に続き，以下のように，それらの機能解析を行った。
１. Acinetobacter sGDHの機能解析
大腸菌高発現株から精製したsGDHのPMS-DCIP還元活性を調べると，中性側の酵素活性では見られず，アルカリ側の酵素活性のみが活性酸素（O2-）スカベンジャー（SOD及びMn）によって阻害された。今回，このO2- 生成反応を詳細に検討し，電子受容体であるPMSの介在による反応以外に，酵素反応で生成するPQQH2によってもO2-が生成している可能性が示された。今後，sGDHによるPQQ還元活性, PQQH2の酵素から離脱の有無，の解析を行う。
２．酢酸菌GLDHの精製とその機能解析
昨年度は，酢酸菌Gluconobacter frateurii CHM43のADH欠損株を作成しGLDHの精製を行ったが，安定な酵素を得ることができなかった。今回，この欠損株にGLDHを過剰発現させて精製を行うことで，そのPurity及び回収率に優れた精製酵素を得ることができた。得られた精製酵素の酵素活性（PMS-DCIP）を調べると，酸性側とアルカリ側と２つの至適pHを有すること，Ca及びMgどちらでもPQQのホロ化が可能なことが示された。これらの精製酵素を用いて，酸性・アルカリpHでの酵素活性のO2-スカベンジャーの影響を調べた結果，sGDHと同様，アルカリ側の酵素活性のみSOD及びMnによって阻害されることが示された。
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