ゲノム編集技術と1細胞ゲノム解析を融合した難培養性微生物の遺伝子機能解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660075
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 雪 真弘 独立行政法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員 (50572773)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: シロアリ腸内原生生物 / CRISPR-Cas9 / セロビオハイドロラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

これまでの難培養性微生物を対象にした多くの解析が、培養を介さないメタゲノム・メタトランスクリプトーム解析であり、個々の微生物の遺伝子機能を明らかにすることは困難であった。本研究では、CRISPR-Cas9システムを用いて、シロアリ腸内に共生する難培養性原生生物の遺伝改変を行い、遺伝子機能解析を行うことを目的とした。平成26年度はCRISPR-Cas9で切断する部位を決定する必要があるため、ヤマトシロアリ腸内に共生する原生生物Trichonympha agilisのドラフトゲノムから標的となる結晶性セルロース分解酵素セロビオハイドロラーゼの探索を行った。まず、ヤマトシロアリ腸内原生生物のメタトランスクリプトーム解析からセロビオハイドロラーゼ遺伝子の配列を取得した。この配列に相同性がある配列をT. agilisのドラフトゲノム配列から構築したBlast検索用データベースから検索を行った。この結果、相同的配列をコードする5個のscaffoldを取得できた。このうち、相同性組換えでセロビオハイドロラーゼ遺伝子とGFP遺伝子を融合した配列を組み込むため、プロモータ、ターミネーター領域が1kb以上あるscaffoldを選択した。このscaffoldにコードされているセロビオハイドロラーゼ遺伝子配列中に、Cas9のターゲットとなるNGGを含む領域を4箇所同定した。このうち、C末端側に近い領域をターゲットし、ガイドRNAの設計を行った。また、ドラフトゲノム配列から得られたセロビオハイドロラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を求めた。これをもとにCas9遺伝子、GFP遺伝子のコドンの最適化を行い、これら遺伝子の合成準備を終えた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画通りにT. agilisのドラフトゲノムから、標的となるセロビオハイドロラーゼ遺伝子を同定し、Cas9の切断部位の選定を行い、ガイドRNAの設計を終えた。また、T. agilisのコドン使用頻度を調べた結果、GC含量が予想より低いことが分かった。そのため、Cas9遺伝子、GFP遺伝子のコドンの最適化した配列のDNA合成に予想以上に費用がかかることが判明した。そのため、平成27年度にガイドRNA、コドン最適化Cas9遺伝子、コドン最適化GFP遺伝子を一括して発注することにした。合成遺伝子が完了すれば、平成27年度で遅れを取り戻れると考えるが、達成度はやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は、合成した最適化GFP遺伝子とセロビオハイドロラーゼ遺伝子の融合配列を作製する。この融合遺伝子とCas9遺伝子、guideRNAをシロアリに注入し、遺伝子改変を試みる。GFP遺伝子の蛍光が観察された原生生物をマイクロマニピュレーションで単離し、ゲノム解析により目的位置に遺伝子が挿入されたのかを確認する。また、遺伝子改変により腸内微生物叢への影響をアンプリコンシーケンスにより評価する。また、GFP遺伝子の代わりに精製用タグのHisタグを付加したセロビオハイドロラーゼ融合遺伝子を作製し、原生生物を改変することで、難発現性タンパク質の発現を行う予定である。

Causes of Carryover

平成26年度にはCRISPR-Cas9システムで使用する遺伝子の合成を行わなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

CRISPR-Cas9システムで使用する遺伝子合成に使用する予定である。